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膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤,临床上,膀胱癌多采用肿瘤切除,术后辅助化疗。然而,由于膀胱癌的高转移性,膀胱癌的复发率及死亡率仍然很高。故研究膀胱癌的转移机制是很有必要的。MTDH是近年来发现的癌基因,已有报道其在恶性肿瘤中表达较高。上皮间质转化(EMT)是上皮细胞获得间质表型,易于侵袭转移的特性,其经典上皮标志物为E-cadherin。有报道显示,在恶性肿瘤中,MTDH可促进EMT发生,而EMT是膀胱癌发生侵袭、转移的重要原因。目前,在膀胱癌中尚无MTDH与EMT的相关研究。本研究拟通过分析在膀胱癌组织及细胞中MTDH与E-cadherin的表达关系,探讨MTDH与EMT是否存在某种联系,进而采用基因沉默及过表达技术,深入研究MTDH对EMT的影响,及MTDH促进膀胱癌细胞侵袭、转移的机制。第一部分MTDH和E-cadherin在膀胱癌组织及细胞中的表达及临床意义目的检测MTDH、E-cadherin在膀胱癌组织及细胞中的表达,探讨MTDH、E-cadherin与临床病理特征的关系,以及MTDH与E-cadherin表达的相关性。方法1.应用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)SP法检测膀胱癌组织中MTDH和EMT上皮标志物E-cadherin的表达水平。分析MTDH、E-cadherin蛋白表达与临床病理特征之间的关系,Spearman’s法分析MTDH与E-cadherin表达可能存在的相关性。2.Real-time PCR方法检测MTDH与E-cadherin在膀胱癌细胞株、尿路上皮细胞株中m RNA的表达水平。3.Western blot方法检测在膀胱癌细胞株、尿路上皮细胞株MTDH与E-cadherin蛋白的表达水平。结果1.与癌旁组织比较,癌组织MTDH的蛋白表达水平明显增高,E-cadherin的表达水平明显降低。MTDH、E-cadherin表达与患者年龄、性别、肿瘤大小、数量无关,与肿瘤远处转移、临床分期、病理分级有关。MTDH与E-cadherin的蛋白表达之间呈负相关(r=-0.722,P<0.05)。2.膀胱癌细胞株5637、T24中MTDH m RNA表达水平相对于人尿路上皮细胞株SV-HUC-1中显著升高;E-cadherin m RNA表达水平在膀胱癌细胞株5637、T24中相对于人尿路上皮细胞株SV-HUC-1中显著降低。3.膀胱癌细胞株5637、T24中MTDH蛋白表达水平相对于人尿路上皮细胞株SV-HUC-1中显著升高;E-cadherin的蛋白表达水平在膀胱癌细胞株5637、T24中相对于其在人尿路上皮细胞株SV-HUC-1中显著降低。结论MTDH在膀胱癌组织及细胞中高表达,E-cadherin在癌旁组织及正常细胞中高表达。MTDH与肿瘤临床病理学特征密切相关,可作为判断肿瘤临床病理的分子指标。MTDH与E-cadherin呈负相关,相互之间存在负向调控。第二部分MTDH基因沉默对膀胱癌细胞功能学影响及其机制研究目的探讨抑制MTDH表达对膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及MTDH沉默对上皮间质转化相关标志物的影响方法1.Real-time PCR检测si RNA-MTDH转染5637和T24细胞后MTDH m RNA变化情况,Western blot方法检测si RNA-MTDH转染5637和T24细胞后,MTDH蛋白表达情况,分析si RNA的抑制效率,最终筛选出沉默效率最高的si RNA。2.通过CCK8法检测MTDH基因沉默后5637和T24的增殖能力的变化,流式细胞术检测MTDH基因沉默对5637和T24细胞凋亡的影响,细胞划痕实验检测MTDH基因沉默对5637、T24细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测MTDH基因沉默对5637、T24细胞的侵袭能力的影响。3.Real-time PCR方法检测si RNA2-MTDH转染5637、T24细胞后上皮间质转化相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin m RNA的表达变化。Western blot检测si RNA2-MTDH转染5637、T24细胞后上皮间质转化相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达变化。细胞免疫荧光技术检测si RNA2-MTDH转染5637、T24细胞后上皮间质转化相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin荧光表达变化。结果1.从基因及蛋白水平验证si RNA2-MTDH沉默效率大于70%,筛选确定si RNA2用于后续实验。2.CCK8法实验结果显示:与对照组相比,MTDH基因沉默后膀胱癌细胞5637、T24的增殖能力明显降低,流式细胞仪检测结果提示MTDH基因沉默后5637、T24凋亡率较对照组明显增加,细胞划痕实验、Transwell实验结果提示MTDH基因沉默后5637、T24细胞迁移及侵袭能力显著降低。3.Real-time PCR、Western blot实验提示si RNA2-MTDH转染5637、T24细胞后上皮相关标志物E-cadherin m RNA及蛋白表达显著增高,而间质标志物N-cadherin、Vimentin m RNA及蛋白表达显著降低。细胞免疫荧光技术检测提示si RNA2-MTDH转染5637、T24细胞后相关标志物E-cadherin荧光表达增强,阳性细胞数增多;而N-cadherin、Vimentin荧光表达减弱,阳性细胞数减少。结论MTDH基因沉默抑制膀胱癌细胞增殖,促进其凋亡,抑制膀胱癌细胞迁移及侵袭,促进上皮标志物表达,抑制间质标志物表达,抑制上皮间质转化。第三部分MTDH过表达对膀胱癌细胞功能学影响及其机制研究目的探讨MTDH过表达对膀胱癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及MTDH过表达对上皮间质转化相关标志物的影响方法1.构建MTDH过表达慢病毒载体GV341-MTDH及GV341-NC,制备慢病毒浓缩液LV-MTDH,LV-NC,感染5637、T24细胞,建立过表达MTDH的LV-MTDH单克隆细胞株及阴性对照组LV-NC细胞株。Real-time PCR检测5637和T24细胞过表达MTDH后MTDH m RNA变化情况,Western blot方法检测5637和T24细胞过表达MTDH后,MTDH蛋白表达情况。2.通过CCK8法检测5637和T24细胞MTDH过表达后增殖能力的变化,流式细胞术检测MTDH基因过表达对5637和T24细胞凋亡的影响,细胞划痕实验检测MTDH基因过表达对5637、T24细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测MTDH基因过表达对5637、T24细胞的侵袭能力的影响。3.Real-time PCR方法检测5637、T24细胞MTDH过表达后上皮间质转化相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin m RNA的表达变化。Western blot检测5637、T24细胞MTDH过表达后上皮间质转化相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达变化。细胞免疫荧光技术检测5637、T24细胞MTDH过表达后E-cadherin、N-cadherin、Vimentin荧光表达变化。结果1.MTDH过表达慢病毒载体构建成功,从基因及蛋白水平证实成功建立过表达MTDH的LV-MTDH单克隆细胞株及阴性对照组LV-NC细胞株。2.CCK8法实验结果显示:与对照组相比,MTDH过表达后膀胱癌细胞5637、T24的增殖能力明显增强,流式细胞仪检测结果提示MTDH过表达后5637、T24凋亡率较对照组明显降低,细胞划痕实验、Transwell实验结果提示MTDH基因过表达后5637、T24细胞迁移及侵袭能力显著增强。3.Real-time PCR、Western blot实验提示5637、T24细胞MTDH基因过表达后上皮间质转化相关标志物E-cadherin m RNA及蛋白表达明显减弱,而N-cadherin、Vimentin m RNA及蛋白表达显著增强。细胞免疫荧光技术检测提示5637、T24细胞MTDH基因过表达后E-cadherin荧光表达减弱,阳性细胞数减少;而N-cadherin、Vimentin荧光表达增强,阳性细胞数增多。结论MTDH基因过表达促进膀胱癌细胞增殖,抑制其凋亡,增强膀胱癌细胞迁移及侵袭能力,抑制上皮标志物表达,提高间质标志物表达,促进上皮间质转化。第四部分MTDH过表达对T24、5637细胞Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的调控目的探讨MTDH过表达对T24、5637细胞Wnt/β-catenin信号通路及其下游靶基因的调控方法1.Western blot检测MTDH过表达对5637、T24细胞Wnt/β-catenin信号通路、下游靶基因及基质金属蛋白酶MMP9蛋白表达的影响2.免疫荧光检测MTDH过表达5637和T24细胞对β-catenin荧光表达的影响结果1.Western blot实验提示5637、T24细胞MTDH基因过表达后Wnt通路被激活,细胞内β-catenin总蛋白表达增多,胞核β-catenin蛋白表达显著增多,而胞质β-catenin蛋白表达明显减低,c-Myc及MMP9蛋白表达显著增加。2.免疫荧光实验提示:5637、T24细胞MTDH基因过表达后,β-catenin蛋白荧光表达增强,阳性细胞数增多,且胞核内表达显著增强。结论慢病毒载体介导的MTDH基因过表达经Wnt/β-catenin信号通路,促进上皮间质转化,增强膀胱癌细胞侵袭能力。