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高血压肾病是全球慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)死亡中的一个非常重要原因,慢性肾病的纤维化是导致终末期器官疾病的标志和常见途径,巨噬细胞向肌成纤维细胞的转变(macrophage-to-myofibroblast transition,MMT)是一种新发现的肾纤维化重要途径,在包括肾移植排异患者在内的慢性肾病患者标本和慢性肾病小鼠模型中,60%到85%的肌成纤维细胞(α-SMA+)均来源于此途径,其中,Smad3是MMT过程和肾纤维化的关键调控因子。课题组通过单细胞转录本测序(sc RNA-seq)成功获得Smad3依赖的MMT转录组特异调控基因,探明Smad3通过结合在P2Y12(G蛋白偶联,GPCR)嘌呤能受体5’UTR区域调控转录,同时也发现P2Y12可以激活TGF-β1/Smad3信号介导血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的高血压肾病的肾脏炎症和纤维化,使用P2Y12特异性拮抗剂氯吡格雷可有效地阻断TGF-β1/Smad3信号介导的体内外MMT、肾脏炎症与纤维化。为了验证以上假设,本研究通过Alzet渗透微型泵皮下每天释放Ang Ⅱ 1.44mg/kg,持续2到4周,建立C57BL/6小鼠高血压模型。小鼠每日经口给生理盐水或20、40、60mg/kg剂量的P2Y12拮抗剂氯吡格雷溶液。每周测量血压和尿蛋白等指标,最后收集血清和肾脏组织进行分析。1.探究P2Y12在高血压患者肾脏标本和Ang Ⅱ诱导的小鼠模型肾脏巨噬细胞上的表达情况。研究表明,在高血压患者肾脏中表达有P2Y12,且发现P2Y12和CD68双阳性细胞,Ang Ⅱ诱导的小鼠模型肾脏巨噬细胞表达量也明显高于对照组,且与Smad3信号相关,证明P2Y12可能跟肾脏炎症和纤维化相关。2.探究不同剂量P2Y12特异性拮抗剂氯吡格雷对小鼠高血压肾病模型中肾脏炎症及纤维化的防、治作用。血压检测结果显示,对比对照组,模型组和给药组均血压升高,但模型组和各剂量给药组血压值无统计学差异,且氯吡格雷不影响Ang Ⅱ诱导的小鼠高血压。同时,模型组与正常组凝血时间无差异,各给药组凝血时间有延长且与单纯给药组结果相似;即氯吡格雷和Ang Ⅱ作用相互独立。Ang Ⅱ可以诱导小鼠肾损伤,给药组抑制Ang Ⅱ诱导致血清肌酐(SCr)、24h尿蛋白、血清乳酸脱氢酶(LDH)等指标升高,改善小鼠肾功能;且各组反映肝功能的血清指标谷丙转氨酶(Alt)并无差异。Western blot和real-time PCR结果显示给药组可降低Ang Ⅱ诱导的肾脏炎症(IL-1β,MCP-1)和纤维化(Col-1,α-SMA)指标表达水平。PAS染色和免疫组化表明,氯吡格雷给药组可改善Ang Ⅱ诱导的小鼠肾脏小管损伤、小球损伤和肾脏纤维化。免疫荧光进一步表明,Ang Ⅱ可诱导模型组P2Y12表达增加、巨噬细胞(F4/80或CD68)增多和双阳性MMT(F4/80或CD68和α-SMA)细胞增多,给药组可降低巨噬细胞和MMT细胞数量。上述结果在四色免疫荧光染色的流式细胞计数实验也得到验证。3.探究P2Y12在体内外Ang Ⅱ诱导肾脏炎症及纤维化中的作用和机制。P2Y12参与Ang Ⅱ诱导的肾脏巨噬细胞浸润导致的炎症和肾脏MMT细胞增多导致的纤维化过程,使用P2Y12特异性拮抗剂氯吡格雷可减轻肾脏炎症和纤维化。综上,我们首次发现P2Y12在肾脏巨噬细胞上表达,并且通过调控TGF-β1/Smad3信号,介导Ang Ⅱ诱导的高血压肾病中的肾脏炎症和纤维化。使用其拮抗剂可减轻Ang Ⅱ诱导的肾脏炎症和纤维化。因此,P2Y12拮抗剂氯吡格雷可能成为治疗高血压肾病的新药物。