肿瘤一直是威胁人类生命的头号杀手,抑癌基因失活(如p53)和原癌基因激活(如RaS)共同作用是导致肿瘤发生发展的主要原因,了解其作用机制对于肿瘤治疗有着重要意义。p53基因是最重要也是被研究最多的抑癌基因,据统计50%人类自发肿瘤中都发生p53的缺失或突变,其主要的突变方式是错义突变。突变后的p53不仅会缺失抑癌基因的功能,同时还可能获得与肿瘤的发生发展相关的潜能。本实验室前期研究中发现用阿霉素(Dxorubicin,Dox,拓扑异构酶I抑制剂)处理p53N236S(p53第236位氨基酸由天冬酰胺突变为丝氨酸,以下简记为p53S)背景的四种细胞:p53S/S+RaS(p53S/S内源表达细胞中转入Ras-pBabe载体),p53S/S,p53-/-+V+Ras(p53基因敲出的细胞中转入一个p53S表达载体的对照空载体vector和Ras-pBabe载体),p53-/-(p53敲出的细胞),以及野生型(WT)细胞时,Western Blot以及Annexin V-FITC/PI双染流式细胞法检测结果显示p53S背景的细胞凋亡显著低于WT细胞(p<0.01),提示p53S蛋白失去野生型p53应激损伤信号并诱导细胞凋亡的功能,进而导致细胞耐药。而p5pS/Sa+Ras细胞凋亡低于p53S/S,且与细胞耐药性相关的多药耐药蛋白1(MDR1)在p53S/S+Ras细胞中高表达,提示p53S和Ras协同作用下,细胞对Dox的耐受能力进一步增强。另外,我们前期的工作中还发现了大量p53S与Ras协同作用的证据,如促进肿瘤形成,细胞增殖,Ras原癌基因在p53S背景下高表达等。以上数据都提示我们p53S在Ras激活的背景下,会以功能获得的方式促进肿瘤进程。目前有大量研究指出活化的癌基因Ras能够激活下游的MAPK(ERK1/2,JNK,p38)途径,通过增加MDR1的表达,从而增强肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐受性。因此本课题从Ras诱导的MAPK途径入手,以揭示Ras-MAPK途径协同p53S抵抗Dox诱导凋亡的机制。我们检测了 WT,p53-/-,p53-/-+V+Ras,p53S/S,p53S/S+Ras五种细胞经过Dox处理后,经典的三条MAPK途径的变化情况,发现Ras主要激活p38,ERK1/2这两条MAPK途径,且在p5pS/S+Ras细胞中,p-p38和p-ERK1/2被上调的最为显著,提示MAPK虽然是由Ras主要激活的,但是p53S在这一过程中起到辅助增强信号的作用。随后,我们发现p53S/S+Ras细胞核内NF-κBp65有较高的表达水平,提示Ras协同p53S通过激活p38和ERK1/2途径,增强NF-κBp65的核定位,从而增强MDR1蛋白的表达,从而增强细胞的抗凋亡能力。我们利用ERK1/2抑制剂(PD0325901)或p38抑制剂(SB203580)联合Dox共处理细胞,以探明ERK1/2、p38是否是Ras协同p53S抗凋亡的主要途径。Western Blot和Annexin V-FITC/PI双染流式细胞法的检测结果显示,在经过这种联合用药策略处理细胞后,p53S/S+Ras细胞凋亡虽然增加,但并没有其它几株细胞显著。提示p38和ERK1/2这两条MAPK途径之间在p53S/S+Ras细胞中可能存在代偿作用。在ERK1/2被抑制的p53S/S+Ras细胞中p-p38表达上调,提示可能是由于p53S/S+Ras细胞中ERK1/2被抑制后,p38代偿性的被激活,从而使细胞与其它基因型相比更能抵抗Dox诱导的凋亡。而p38被抑制后,p-ERK1/2仅出现了略微上调的代偿效果,提示p38可能是Ras协同p53S抗凋亡的主要途径。在当前对肿瘤耐药的机制研究中发现,当肿瘤细胞产生耐药表型时,细胞不仅可以对一种药物产生耐药性,也会对其它结构和作用机制不同的化疗药物产生耐药表型。那么,在p53S突变的细胞中是否也会存在这种现象?我们采用顺铂(Cisplatin,DDP,其作用机理是与DNA形成加合物,进而抑制DNA的复制过程)来处理p53SS细胞,DDP处理的细胞并没有像Dox 一样有明显的抗凋亡的作用,而是出现了略微高于WT细胞的凋亡情况,这一发现引起了我们的注意,这种现象是否是由于药物作用机理不同导致的?为了验证这一猜想,我们选取作用机理与Dox相同或相似的依托泊苷(Etoposide,ETO)以及喜树碱(Camptothecin,CAM);以及与DDP作用机理相似的卡莫司汀(Carmustine,CAR),初步探究不同药物作用机理对p53S/S细胞的杀伤能力。结果显示,用拓扑异构酶抑制剂类药物处理后,p53S/S细胞均表现出了明显的抗凋亡现象,而用与DNA形成加合物的药物处理后,p53S/S细胞表现出了略微高于野生型WT的凋亡现象。随后,我们初步探究p53S/S细胞对DDP敏感的机制,Western Blot实验结果表明p-p53(ser15)蛋白在DDP处理后的p53S/S+Ras细胞中有较高的表达,且随着时间的增加而递增。另外,在这种细胞中,Hsp70和Hsp90略微上调,同时Bax凋亡蛋白表达上升,Bcl-2抗凋亡蛋白下调,提示DDP能够诱导p53S/S细胞发生凋亡。综上所述,通过本课题的研究,我们进一步证明了 p53S/S+Ras细胞与p53S/S,p53S/S+V+RaS相比,有较强的抗凋亡能力。另外,在检测Ras相关的MAPK途径时我们发现,与其它基因型的细胞相比,p53S/S+Ras细胞在Dox处理后p-ERK1/2、p-p38都有明显的高表达,提示ERK1/2、p38的激活与Ras协同p53S耐受Dox诱导的凋亡相关,且在使用ERK1/2抑制剂处理p53S/S+Ras细胞时p38具有明显的代偿作用,而用p38抑制剂处理后,与其它细胞相比有较强的凋亡现象,提示p38可能是Ras协同p53S抗凋亡的主要途径。另一方面,我们发现在使用不同作用机理的抗肿瘤药物处理p53S/S细胞时,会产生不同的生物学后果,提示p53S细胞的耐药性与药物作用机理相关。本研究的意义在于初步揭示了 Ras激活的MAPK途径协同p53S耐Dox凋亡的机理,此外,本研究的结果对于临床上同时存在p53S和Ras突变的肿瘤用药具有一定理论价值。