研究背景与目的糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病的严重并发症之一,也是终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要原因,同时,它也被认为是许多心血管疾病的独立危险因素。但目前关于其发生发展的病理生理机制还不完全清楚。自噬(autophagy)是细胞内溶酶体的降解途径之一,目的是去除细胞内过量的蛋白质聚集体,同时清除掉受损或多余的细胞器,从而保持细胞的内环境平衡。自噬可由各种应激条件(比如缺氧、内质网应激或氧化应激)激活,而肥胖或糖尿病所致的代谢功能障碍可损害自噬作用。研究证明,DKD状态下肾脏自噬水平明显受抑制,激活自噬可以起到保护肾脏的作用。Klotho是一种抗衰老因子,并且其选择性地高表达于肾脏,特别是肾小管上皮细胞,目前普遍观点认为其是一种主要由肾脏分泌的激素,在各种急、慢性肾脏病中发挥着保护作用。在DKD早期阶段,患者血清中的Klotho蛋白已呈下降趋势,并且其下降幅度随着DKD的进展越来越明显。因此,血清Klotho蛋白下降的水平被认为是DKD进展水平的重要生物标志物之一。目前,在糖尿病肾脏病方面尚无关于klotho与自噬的关系的研究。本研究旨在研究DKD状态下klotho与自噬的相关性,并且探索klotho是否可通过AMPK及ERK通路来改善肾脏自噬水平,从而起到肾脏保护作用,为进一步理解klotho及自噬在糖尿病肾脏病的发病机制上提供新的理论依据。方法1、动物实验使用实验室已经用STZ/HFD方法构建好的糖尿病(DM组)小鼠模型,使用同种正常(control组)小鼠作为对照。取1w、6w、18w的DM组和control组小鼠的肾脏组织,通过RT-qPCR、westernblot等方法来检测其分子生物学指标,免疫组化法分析肾皮质中LC3B蛋白表达情况。同时,在DM组小鼠造模12w时通过尾静脉注射质粒的方法构建出肾脏klotho过表达模型,取肾脏组织行RT-qPCR、western blot方法检测分子生物学指标,免疫组化法分析肾皮质中LC3B蛋白表达情况。2、细胞实验使用实验室保存的人肾小管上皮细胞株(HK2),用含10%FBS的1640基础培养基进行培养,并放置在37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育,待培养基变黄或每3天更换培养基一次。当其在10cm细胞培养皿上长至约80%时,便将其消化后接种于6孔板中,按转染质粒及时间梯度进行分组:24h/空载质粒对照组(pcDNA-Vector)+klotho 过表达组(pcDNA-klotho);48h/pcDNA-Vector +pcDNA-klotho;72h/pcDNA-Vector + pcDNA-klotho。细胞饥饿 12-24h 后,转染相应质粒并改用高糖(Glu30mM)培养基继续培养。收板后行RT-qPCR、western blot检测分子生物学指标,电镜观察细胞自噬体形态。3、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)通过Trizol法提取出组织及细胞的总mRNA。添加M-MLV逆转录酶试剂以使得mRNA能够逆转录为cDNA。SYBR法在罗氏480 PCR仪上进行实时荧光定量PCR反应,按2-△△Ct方法计算得出目的基因表达量。4、免疫印迹(Western Blot)通过RIPA法提取出组织及细胞的总蛋白质。配制SDS-PAGE分离胶,添加蛋白样品,经电泳仪分离后,湿转到PVDF膜上,随后封闭液封闭PVDF膜。4℃下一抗孵育摇床过夜后,室温下二抗孵育1-2h,TBST漂洗。使用天能Tanon 5500全自动化学发光成像分析系统发光显影,Image J软件分析结果。5、免疫组织化学取新鲜的小鼠肾脏标本,用4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋、切片。经过脱蜡、水化、抗原修复和封闭后,用兔抗LC3多克隆抗体孵育,再孵二抗,用DAB显色后苏木素复染,再经蓝化和脱水后中性树胶封片,正置显微镜下观察玻片并拍照。6、电镜用电镜固定液、锇酸等固定细胞标本后,梯度酒精及丙酮脱水,丙酮及812包埋剂渗透,随后包埋并行超薄切片。使用铀铅双染色的方法染色后,使用透射电子显微镜观察拍照,采集图像进行分析。7、统计学分析所有实验数据使用SPSS 19.0软件进行分析,并使用均数±标准差(x±SD)的方式表示,多组数据之间的比较则采用单因素方差分析,正态分布两样本之间的比较则采用两独立样本t检验,当统计结果的P值<0.05时,被认为具有统计学差异。结果1、klotho和LC3B在不同病程阶段的糖尿病小鼠肾脏的表达差异(1)与control组相比,造模后1w的DM组的klothomRNA稍有下降,但无统计学差异;6w时呈明显降低趋势;18w时进一步降低。(2)与control组相比,DM组小鼠在1w时LC3B水平稍增高,而6w和18w时,DM组均呈现明显的自噬受损情况,且18w时自噬受损幅度较6w更大。(3)与control组相比,18w时DM小鼠肾皮质的LC3B蛋白的表达明显减少,在klotho的主要表达区域——肾小管尤为明显。2、糖尿病小鼠过表达klotho后肾皮质自噬的改变(1)通过尾静脉注射质粒的方法构建的pCMV-Klotho的小鼠的肾皮质中klotho mRNA 明显高于 pCMV-Vector 小鼠。(2)与pCMV-Vector组相比,pCMV-Klotho组的小鼠肾脏皮质的LC3B蛋白含量明显增高。(3)pCMV-Klotho组的小鼠肾脏皮质的LC3B蛋白在肾小管区域表达明显升高,这和klotho的表达区域一致。3、高糖培养的HK2细胞过表达klotho后体内自噬的改变(1)转染质粒后高糖培养24h后,pcDNA-Klotho组相比于pcDNA-Vector组,细胞中klotho mRNA明显升高。(2)在pcDNA-Vector组中,相比于高糖培养24h和48h组,72h组的LC3B含量明显下降。(3)与 pcDNA-Vector 相比,pcDNA-Klotho 组体内 LC3B 的含量升高,二者差异在72h时最为明显。(4)电镜观察质粒转染和高糖培养72h后的HK2细胞,显示pcDNA-Klotho组的细胞质内可见显著的包裹了受损细胞器及其他胞浆成分的自噬体,而pcDNA-Vector未见到明显的自噬体结构。4、klotho对DKD下肾脏自噬的作用机制研究(1)pCMV-Klotho组的糖尿病小鼠相比于pCMV-Vector组的小鼠肾皮质的AMPK磷酸化水平更高,ERK的磷酸化水平降低。(2)pcDNA-Klotho组的HK2细胞体内依然可以观察到AMPK磷酸化水平的升高和ERK磷酸化水平的降低。结论1、DKD状态下,小鼠肾脏皮质的klothomRNA表达逐渐降低,且自噬作用的下降幅度越来越大,这与klotho的表达趋势一致。2、随着高糖刺激的延长,人肾小管上皮细胞的自噬受抑制的情况越来越明显。3、过表达klotho可以引起糖尿病小鼠的肾脏皮质的自噬水平上调,在高糖培养的HK2细胞晚期依然可以上调自噬水平。4、Klotho可以上调AMPK磷酸化和下调ERK磷酸化的表达,这可能是其改善DKD下的肾脏自噬受抑制情况的机制之一。