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研究背景： 轮状病毒（Rotavirus，RV）是婴幼儿腹泻病最常见的病原体，以水样便为主要症状，容易并发脱水、酸中毒及电解质紊乱，临床上以补液等对症治疗为主。关于RV肠炎的发病机制尚未完全阐明，前期本课题组研究发现乳鼠RV肠炎肠上皮水通道蛋白1（Aquaporin-1，AQP1）表达下降，因此，我们推测AQP1是否参与了相关水的吸收及丢失。 AQP1是细胞膜上转运水的特异性通道，介导水分子的跨膜转运，除是水通道外，还是cGMP离子通道并且与细胞膜水转运有关。该发现已越来越受到关注，AQP1离子通道在细胞的表达已成为新的研究热点。目前，脉络丛上皮细胞、转染人AQP1质粒蟾蜍卵母细胞、视网膜色素上皮细胞、脂质双分子层的AQP1已证实是cGMP离子通道并且参与跨细胞膜流体转运，但肠上皮细胞的研究仍未开展。故本实验拟培养大鼠肠上皮细胞及构建AQP1-siRNA干扰，从Western blot、细胞肿胀实验、全细胞膜片钳技术及荧光黄透过率检测AQP1蛋白表达量、AQP1离子通道功能与细胞水通透性关系，探索AQP1离子通道功能对肠上皮细胞水转运的调节作用。 研究目的： 通过干扰AQP1蛋白模型的建立，探索AQP1离子通道功能对肠上皮细胞水通透性的影响，为临床研究轮状病毒肠炎肠上皮细胞水转运的分子机制提供理论依据。 研究方法： 1.培养大鼠肠上皮细胞株(IEC-6)，合成特异性的 AQP1-siRNA片段，用FECTTM CP试剂转染 IEC-6，正常对照组为非转染的 IEC-6，实验干扰组为 siRNA转染的IEC-6。 2.采用Western blot检测对照组及干扰组 AQP1蛋白表达，细胞肿胀实验检测AQP1介导肠上皮细胞水转运，膜片钳技术及荧光黄透过率检测肠上皮细胞 cGMP依赖性 AQP1离子通道功能与细胞水通透性的关系。 3.采用SPSS13.0进行统计学分析，数据用均数±标准差（x±s)表示，均数的比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。 结果： 1.AQP1-siRNA转染 IEC-6细胞：转染24 h后，荧光显微镜下观察成功转染的细胞发出明亮的红色荧光，未转染的细胞未见荧光表达，荧光可持续至转染后96 h。 2.Western blot检测对照组及干扰组细胞 AQP1蛋白：对照组及干扰组均有AQP1蛋白的表达。转染 AQP1-siRNA96 h的 IEC-6细胞 AQP1蛋白表达水平与对照组比较，下降60％，差异有统计学意义（t=31.862，P<0.001）。 3.细胞肿胀实验：对照组及干扰组细胞的面积均随着时间的增加而增大，对照组细胞由1.000增大至300 s的1.217±0.011，干扰组增大至1.123±0.010，对照组细胞肿胀速率大于干扰组，差异有统计学意义（t=107.965，P<0.001）。 4.膜片钳技术： 4.1细胞外液予硝普钠（SNP）刺激时，对照组细胞电流密度（pA/pF）为-7.348±0.134，灌入10 mM SNP作用至稳定后（7 min）电流密度增大至-24.093±0.509，差异有统计学意义（t=73.712，P<0.001）。干扰组细胞电流密度稍增大，由-9.300±0.106增大至-15.025±0.378，差异无统计学意义（t=3.569，P>0.05）。对照组和干扰组细胞予 SNP刺激，两者电流密度差异有统计学意义（t=84.700，P<0.001）。 4.2细胞外液予8-Br cGMP刺激时，对照组细胞电流密度为-4.730±0.053，灌入10 mM8-Br cGMP作用至稳定后（20 min）电流密度增大至-14.985±0.263，差异有统计学意义（t=97.139，P<0.001）。与 SNP比较，8-Br cGMP刺激 IEC-6细胞 AQP1离子电流密度差异有统计学意义（t=48.763，P<0.001）。 5.荧光黄透过率：IEC-6细胞在直径12 mm transwell小室培养21天，细胞融合形成完整致密的单层，基本对荧光黄不通透，达到实验所需。在基底加10 mM8-Br cGMP孵育，IEC-6细胞对荧光黄通透性增大，从（0.522±0.092）%增加至（2.180±0.024）%，差异有统计学意义（t=131.526，P<0.001）。 结论： 1.合成的特异性 AQP1-siRNA片段，可成功降低 AQP1蛋白在肠上皮细胞的表达。 2.AQP1参与肠上皮细胞水转运，AQP1蛋白表达下降可减少肠上皮细胞对水的吸收。 3.cGMP激动剂可激活肠上皮细胞产生电流，AQP1蛋白表达下降可减少肠上皮细胞 cGMP依赖性电流，cGMP激活的离子电流需要由 AQP1介导。SNP刺激肠上皮细胞 cGMP依赖性激活的 AQP1离子电流较8-Br cGMP快且大。 4.肠上皮细胞cGMP依赖性AQP1离子电流的激活可增加肠上皮细胞水通透性。