论文部分内容阅读
随着临床上对疾病诊断要求的不断提高,传统的一些检测手段逐渐无法满足检测需求,尤其对于肿瘤的诊断。众所周知,肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一,为了提高肿瘤的治愈率,增加肿瘤病人的生存率,临床上对肿瘤的诊断,要求更高的灵敏度和准确性。而在众多检测方法中,荧光探针作为分析传感和光学成像的强大工具,可以直接在分子水平上对生物分析物进行可视化分析,并为复杂的生物结构和过程提供有用的信息。细胞内各种生物标志物,如DNA,RNA以及生物酶,都可以利用荧光探针进行检测。由此可见,荧光探针在肿瘤细胞的可视化检测方面具有巨大潜力。传统的荧光分子大多难溶于水,并且在水溶液中会因荧光分子的聚集而导致荧光猝灭,即聚集引起猝灭（aggregation-caused quenching,ACQ）现象,所以使得基于它们所设计的荧光探针只能在较低浓度的水溶液中发光,并且非常容易受背景信号或假阳性信号干扰,这些缺陷很大程度上限制了其在生物体亲水环境中的应用,影响其检测结果的准确性。因此,如何利用荧光探针灵敏、准确地获取生物体中的重要信息,借此实现肿瘤准确诊断,仍然是科学家们亟待解决的重大难题。目前,荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）原理被广泛应用于各种荧光探针的设计,以此来提高探针的灵敏度和准确性。通过运用FRET原理能够在一定程度上降低ACQ类荧光分子的背景信号和假阳性信号等问题,但仍不能从根本上消除ACQ类荧光分子的固有缺陷。2001年,唐本忠院士率先提出了与ACQ现象相反的聚集诱导发光（aggregation-induced emission,AIE）概念,与ACQ类荧光分子不同,AIE荧光分子在稀溶液中微弱发光或者不发光,而当其聚集状态或者固态时会有明亮的荧光发出,这就使得此类荧光分子可以从根本上避免ACQ类荧光分子的一些弊端。本论文以提高体外肿瘤细胞检测结果准确性为目标,基于AIE理论和FRET原理,设计了三种荧光探针检测策略:（1）提高检测目标特异性成像信号对比度;（2）双肿瘤标志物协同成像检测;（3）用不同荧光信号同时检测区分特异性信号和假阳性信号。首先,设计合成一种用于原位检测肿瘤细胞内碱性磷酸酯酶（alkaline phosphatase,ALP）活性的AIE荧光探针,利用AIE荧光分子聚集诱导荧光发光的特点,使荧光信号原位集中,成像信号对比度提高,检测结果更准确。然后,相对于单一肿瘤标志物检测,双肿瘤标志物协同检测能够显著提高检测结果准确性,所以我们通过运用FRET原理,设计了一种荧光鸡尾酒纳米粒子,来实现细胞内mRNA与H2O2双响应的协同检测,降低了核酸探针假阳性信号干扰,并将肿瘤、炎症和正常细胞的同时分离,显著提高了肿瘤细胞检测准确性。最后,在前面工作的基础上,针对细胞内核酸荧光探针不可避免的假阳性信号造成的检测结果不准确问题,我们通过AIE与ACQ荧光分子的组合运用,设计了一种AIE分子信标AIE-MB来解决这一难题。AIE-MB对肿瘤细胞内目标mRNA进行特异性检测的同时,可以利用不同荧光信号成功的区分出正常细胞内的假阳性信号,通过不同荧光信号的对比来达到更准确的肿瘤检测效果。具体研究内容概况如下。1.用于肿瘤细胞内ALP活性原位检测的AIE荧光探针设计传统的酶响应荧光探针的荧光会从反应位点扩散到细胞内其他位置,很难在细胞内对其特异性响应的酶进行原位检测,从而存在信号对比度低、准确度差的问题。为了解决这一难题,本章工作中设计合成了一种酶响应的具有AIE特性的水溶性荧光探针,它能够在与细胞内活性酶响应后,原位聚集沉淀并释放荧光。这种水溶性AIE荧光探针（TPEQHA）是在一种新型AIE类分子四苯乙烯-喹喔啉酮（TPEQH）上引入一个能被ALP特异性水解的磷酸根基团制备而成。在肿瘤细胞内,TPEQHA上的磷酸根在被高表达的ALP特异性水解后,产生不溶于水的TPEQH,原位沉淀聚集释放荧光。由于其荧光信号集中在ALP的反应位点而不扩散,显著提高了荧光信号对比度,使得成像结果更准确性。通过对细胞内ALP表达水平的检测,可以区分肿瘤细胞和正常细胞,实现肿瘤的准确诊断。2.荧光鸡尾酒策略:通过检测细胞内mRNA与H2O2分辨肿瘤、炎症和正常细胞本章工作中设计了一种能够同时检测细胞内mRNA和H2O2的荧光鸡尾酒纳米粒子来区分肿瘤细胞和非肿瘤细胞。首先,在能够组装形成纳米粒子的两亲性聚合物上连接了H2O2检测荧光探针,使其能够检测细胞内高表达的H2O2;其次,包裹在纳米粒子内部的DNA荧光探针通过FRET设计原理降低了细胞中假阳性信号的产生,其被转运到细胞内释放后能够特异性检测细胞内目标mRNA。在细胞中,根据细胞内H2O2检测探针的响应变化,可以将细胞内H2O2浓度高的肿瘤细胞和炎症细胞与正常细胞区分开来。与此同时,根据肿瘤细胞与非肿瘤细胞中肿瘤相关mRNA表达水平的不同,DNA荧光探针与目标mRNA特异性配对响应后释放的荧光信号可以来进一步区分肿瘤和炎症细胞。综上所述,我们所提出的荧光鸡尾酒策略,可以通过对细胞内mRNA和H2O2双响应的协同检测,来同时区分肿瘤细胞、炎症细胞和正常细胞,显著提高肿瘤检测结果的准确性,实现肿瘤准确诊断。3.通过检测特异性和假阳性信号来区分肿瘤和正常细胞的AIE分子信标的构建为了区分核酸探针在细胞内受核酶或其他生物活性物质干扰所产生的假阳性信号,在前面工作基础上设计了一种AIE荧光分子,并利用这种AIE荧光分子和FRET原理构建了一种新型AIE分子信标（AIE-MB）。通过实验和理论计算确定该AIE荧光分子（四苯乙烯-喹喔啉酮,tetraphenylethylene-quinoxaline,TPEQ）具有典型的AIE性质。在此基础上,通过在一条能形成茎-环结构的DNA单链两端分别标记两个具有FRET作用的荧光分子来构建AIE-MB:TPEQ受体AIE荧光团和香豆素（AMCA）供体ACQ荧光团。基于这两种荧光分子,AIE-MB可以表现出三种不同的状态:荧光猝灭的初始状态,肿瘤细胞中与目标mRNA互补配对后释放明亮的蓝色荧光（特异性信号）以及在正常细胞中由于部分探针被内源性降解而产生绿色和蓝色荧光（假阳性信号）。综上所述,肿瘤细胞中目标mRNA的特异性成像和正常细胞中内源性降解产生的假阳性信号可以通过不同颜色的荧光信号被直观的区分开来。通过特异性型号和假阳性信号的对比,区分了假阳性信号干扰,显著提高了肿瘤检测结果的准确性。