糖尿病周围神经病(diabetic peripheral neuropathy,DPN)是糖尿病常见的慢性并发症之一,损害周围神经的髓鞘和轴索,导致周围神经传导速度减慢和动作电位波幅降低,造成患者出现一系列感觉、运动和自主神经功能障碍,如:肢体麻木、疼痛、感觉异常甚至肌无力和肌肉萎缩,严重影响患者的生活质量。Unger等人研究发现糖尿病大鼠有髓神经纤维(腓肠神经)的横切面积下降,主要源于髓鞘变薄,而非轴索直径的改变。雪旺氏细胞参与了周围神经髓鞘的形成和再生,是维持周围神经生理功能的关键组分。雪旺氏细胞的损伤是引起糖尿病周围神经病发生的机制之一,在糖尿病动物模型中可检测到雪旺氏细胞的凋亡,进一步揭示葡萄糖和一些来源于葡萄糖的代谢产物,如丙酮醛(methylglyoxal,MG)和晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)是导致糖尿病雪旺氏细胞凋亡的主要因素。细胞凋亡的发生可由多种途径来介导,包括线粒体介导的凋亡途径、内质网应激介导的凋亡途径和死亡受体介导的凋亡途径。线粒体介导的凋亡通过调控线粒体膜上的促凋亡分子(Bax)和抗凋亡分子(Bcl-2、Bcl-XL)的比例,增加线粒体膜的通透性,使细胞色素C释放入胞浆,激活caspase-3引起细胞凋亡。内质网应激介导的凋亡始于大量非折叠蛋白在内质网的集聚,引起内质网应激反应,激活IRE1、PERK和ATF6通路,通过上调DDIT3和XBP-1的拼接,最终导致细胞凋亡。线粒体及内质网应激介导的凋亡被报道参与了糖尿病雪旺氏细胞的凋亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是mTOR通路的核心蛋白,参与调控多种细胞功能,如细胞增殖、凋亡、迁移和分化等。在哺乳动物中,mTOR有两种复合物形式,mTOR复合物1(mTOR complex 1,mTORC1)和mTOR复合物2(mTOR complex 2,mTORC2)。mTORC1由mTOR、RAPTOR、DEPTOR、PRAS40、mLst8和FKBP38组成,影响蛋白质翻译、mRNA生成和核糖体形成等过程。mTORC2由mTOR、RICTOR、DEPTOR、Protor、mLst8和mSin1组成,可磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)。mTOR通路对细胞凋亡的调控在多种肿瘤细胞中被证实,mTOR抑制剂RAD001可显著增强顺铂介导的A549细胞凋亡,在前列腺癌细胞系中通过化学抑制剂联合抑制mTOR和ERK信号通路,上调了促凋亡因子Bim的表达,并且抑制了细胞增殖。然而,mTOR信号通路是否在糖尿病周围神经病中调节雪旺氏细胞凋亡过程及其确切机制尚未阐明。因此,本研究旨在通过检测糖尿病小鼠和高糖培养的大鼠雪旺氏细胞(rat Schwann cell,RSC96)中凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3,GRP78,DDIT3,XBP-1)和mTOR通路相关基因(mTOR,S6K1,4EBP1)的表达,探讨m TOR通路对糖尿病周围神经病雪旺氏细胞凋亡的影响及机制。研究论文共分为三部分,第一部分:糖尿病周围神经髓鞘损害及mTOR通路和凋亡相关蛋白的表达情况。第二部分:高糖刺激的雪旺氏细胞中m TOR通路对凋亡相关途径的影响。第三部分:mTORC1及下游靶点对高糖刺激雪旺氏细胞线粒体途径介导凋亡的影响。第一部分糖尿病周围神经髓鞘损害及mTOR通路和凋亡相关蛋白的表达情况目的:通过检测糖尿病周围神经病患者下肢远端感觉、运动神经的传导速度、动作电位波幅,明确DPN是否存在周围神经髓鞘损伤和/或轴索损伤及二者是否相关。构建糖尿病小鼠模型,留取坐骨神经进行mTOR通路、线粒体凋亡途径相关蛋白(Bcl-2、Bax)、内质网应激介导的凋亡相关蛋白(GRP78、DDIT3和XBP-1)的检测,初步探求糖尿病周围神经病中mTOR通路活性和凋亡的关系。方法:1.肌电/诱发电位仪检测23例糖尿病周围神经病患者双下肢腓肠感觉神经、腓总运动神经的传导速度及动作电位波幅,并进行相关性分析。2.CD1小鼠腹腔注射STZ制备I型糖尿病模型,喂养16周,经水合氯醛深度麻醉并处死,留取坐骨神经,Western blot检测phospho-mTOR(Ser2448)和mTOR的表达;TUNEL检测细胞凋亡;免疫荧光检测Bcl-2、Bax、GRP78、DDIT3和XBP-1的表达;免疫组织化学方法检测cleaved caspase-3的表达。结果:1.糖尿病周围神经病患者腓肠感觉神经和腓总运动神经传导速度减慢、动作电位波幅降低,二者具有显著相关性(P<0.05)。2.与正常小鼠相比,糖尿病小鼠坐骨神经中活化mTOR减少了49.48%(P<0.05),而mTOR表达量在两组间未见差异;TUNEL检测显示糖尿病小鼠坐骨神经中凋亡细胞数量比正常小鼠明显增加;免疫荧光法发现,糖尿病小鼠坐骨神经中Bcl-2较正常小鼠中减少,相反Bax表达量增加,内质网应激凋亡途径相关因子GRP78和DDIT3在糖尿病小鼠坐骨神经中均明显升高;免疫组化揭示糖尿病小鼠坐骨神经中cleaved caspase-3表达也显著升高。小结:1.糖尿病周围神经病同时存在周围神经髓鞘损害(表现为神经传导速度减慢)和轴索损害(表现为动作电位波幅降低),二者显著相关提示糖尿病周围神经病的髓鞘与轴索损害可能相互影响、同步发展。2.mTOR通路在糖尿病小鼠坐骨神经中被明显抑制,表现为磷酸化mTOR的显著减少,同时揭示坐骨神经中细胞凋亡增多,且线粒体凋亡途径和内质网凋亡途径相关基因均发生变化,提示糖尿病小鼠坐骨神经中mTOR通路的抑制可能参与了线粒体和内质网介导的细胞凋亡。第二部分高糖刺激的雪旺氏细胞中mTOR通路对凋亡相关途径的影响目的:检测高糖刺激的雪旺氏细胞中磷酸化mTOR、线粒体凋亡途径相关基因和内质网凋亡途径相关基因的表达;并分别给予mTOR通路的抑制剂和激活剂,检测凋亡及相关基因表达的变化,最终明确高糖刺激的雪旺氏细胞中mTOR通路对凋亡相关蛋白的影响。方法:1.细胞培养及分组:大鼠雪旺氏细胞(rat Schwann cell,RSC96)采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养。(1)为研究高糖对mTOR通路和凋亡的影响,RSC96细胞被分为3组:正常糖组、高糖组和甘露醇组;(2)为研究mTOR通路抑制对细胞凋亡的影响,RSC96细胞被随机分为4组:正常组、DMSO组、Torin 1组(500 nmol/L Torin 1)和雷帕霉素组(100 nmol/L雷帕霉素);(3)为阐明mTOR通路激活是否可逆转高糖诱导的凋亡,RSC96细胞被分为3组:高糖组、高糖+DMSO组和高糖+MHY1485组(10μm MHY1485)。2.Western blot检测phospho-mTOR(Ser 2448)、m TOR、Bcl-2、Bax、GRP78、DDIT3、XBP-1s和cleaved caspase-3。3.免疫细胞化学检测cleaved caspase-3。4.TUNEL检测细胞凋亡。结果:1.高糖导致RSC96细胞中磷酸化mTOR减少,促进细胞凋亡发生与正常糖组相比,高糖处理72 h后RSC96细胞中phospho-mTOR(Ser2448)表达量降低40.12%,Bcl-2表达量降低48.17%,Bax表达量增加86.53%,cleaved caspase-3增加1.46倍(P<0.05)。内质网应激途径相关蛋白GRP78、DDIT3和XBP-1s在给予高糖刺激的RSC96细胞中均出现减少,统计分析显示较正常糖组GRP78、DDIT3和XBP-1s分别下降了45.69%、81.88%和23.92%(P<0.05)。免疫细胞化学进一步证实高糖处理的RSC96细胞中,cleaved caspase-3表达量显著上调且主要定位于胞核。TUNEL检测证明高糖可以引起RSC96细胞凋亡增加。2.抑制mTOR通路可诱导RSC96细胞发生线粒体途径介导的凋亡与正常对照细胞和DMSO对照细胞相比,mTOR通路抑制剂Torin 1和雷帕霉素均显著降低了phospho-mTOR(Ser 2448)的表达。与DMSO组相比,Torin 1和雷帕霉素处理的RSC96细胞Bcl-2分别降低了40.13%和43.44%,而Bax分别增加了78.27%和71.65%。免疫细胞化学揭示mTOR抑制可增加细胞核内cleaved caspase-3的表达。TUNEL结果显示,与正常组和DMSO组相比,Torin 1组和雷帕霉素组中凋亡细胞增加。3.激活mTOR通路阻止了高糖引起的RSC96细胞线粒体途径凋亡与单用高糖处理的细胞相比,高糖加DMSO处理的RSC96细胞中Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的表达量没有明显差别(P<0.05),而给予mTOR通路激活剂MHY1485后Bcl-2表达上调,Bax和cleaved caspase-3表达下降。免疫细胞化学证实MHY1485可抑制高糖处理的RSC96细胞中cleaved caspase-3的表达。TUNEL检测证实MHY1485减少了细胞凋亡。小结:1.高糖显著抑制雪旺氏细胞mTOR通路,导致线粒体途径而非内质网途径介导的细胞凋亡。2.mTOR通路抑制剂可导致雪旺氏细胞发生线粒体途径介导的凋亡。3.mTOR通路激活剂可抑制线粒体凋亡途径,逆转高糖诱导的雪旺氏细胞凋亡。第三部分mTORC1及下游靶点对高糖刺激雪旺氏细胞线粒体途径介导凋亡的影响目的:上部分实验证实高糖显著抑制雪旺氏细胞mTOR通路,导致线粒体途径介导的细胞凋亡,本部分针对mTORC1、mTORC2及其下游靶点进行检测和相关调控,明确mTOR通路对高糖刺激雪旺氏细胞线粒体途径介导凋亡的下游调控网络。方法:1.细胞分组:(1)为区别mTORC1和mTORC2对细胞凋亡的影响,RSC96细胞被分为4组:正常对照组、对照si RNA转染组、RAPTOR siRNA转染组和RICTOR siRNA转染组;(2)为阐明高糖处理细胞中mTORC1的下游靶基因,RSC96细胞被分为3组:正常糖组、高糖组和甘露醇组;(3)为阐明S6K1在高糖介导的细胞凋亡中的作用,RSC96细胞被分为3组:正常糖+S6K1野生型质粒转染组、高糖+S6K1野生型质粒转染组和高糖+S6K1持续激活型质粒转染组。2.Western blot检测Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、phospho-S6K1、S6K1、phospho-4EBP1、4EBP1。3.TUNEL检测细胞凋亡。结果:1.RAPTOR或RICTOR抑制对RSC96细胞中Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的影响Western blot结果显示RAPTOR siRNA导致RSC96细胞Bcl-2表达量降低,Bax和cleaved caspase-3表达量增高,而RICTOR siRNA转染未造成Bcl-2,Bax和cleaved caspase-3的表达改变。2.高糖对雪旺氏细胞mTORC1下游靶点S6K1和4EBP1磷酸化的影响Western blot检测结果显示高糖刺激RSC96细胞中phospho-S6K1(Thr389)表达降低,而S6K1表达没有显著改变。4EBP1和phospho-4EBP1(Thr37/46)的表达量在正常糖组、高糖组和甘露醇对照组间没有明显差别(P>0.05)。3.S6K1的持续性激活阻止了高糖引起的RSC96细胞凋亡野生型S6K1质粒(pRK7-HA-S6K1-WT)转染RSC96细胞后,给予高糖刺激后引起Bcl-2降低,Bax和cleaved caspase-3增加;相反,转染持续激活型S6K1质粒(pRK7-HA-S6K1-E389-deltaCT)的RSC96细胞再给予高糖刺激后,未出现上述凋亡相关改变。小结:1.mTORC1而非mTORC2参与了高糖导致的雪旺氏细胞线粒体途径介导的凋亡。2.S6K1作为mTORC1的下游靶点,参与了高糖诱导的雪旺氏细胞线粒体途径介导的凋亡,激活S6K1可逆转高糖引起的雪旺氏细胞凋亡。结论:糖尿病周围神经病引起周围神经髓鞘和轴索损害,二者相互影响、同步发展。实验研究表明,糖尿病高糖环境可导致雪旺氏细胞mTOR通路抑制,引起线粒体途径介导的凋亡,表现为Bax的升高和Bcl-2的降低;mTOR参与形成的mTORC1及其下游靶点S6K1是高糖刺激的雪旺氏细胞凋亡的主要调控因子,而激活mTORC1/S6K1通路是避免糖尿病雪旺氏细胞凋亡的有效手段。