论文部分内容阅读
第一部分利用慢病毒载体建立Fractalkine基因敲低的HK2稳定细胞株实验研究目的:利用慢病毒载体建立fractalkine(FKN)基因敲低的HK2稳定细胞株,为探讨FKN基因在肾脏组织肾小管上皮细胞(human renal proximal tubular cell,HK2)转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)重构中的作用奠定实验基础。方法:通过双酶切将FKN目的基因连接到GV248载体(hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin),经扩增、转化、验证、测序、质粒抽提,将携带目的基因的工具GV248载体质粒及病毒包装辅助质粒Helper1.0、Helper2.0转染293T细胞,完成慢病毒包装及质量检测后获取慢病毒工具载体LV-FKN-RNAi,病毒感染HK2细胞72小时后筛选稳定表达的细胞株HK2/LV-FKN-RNAi,采用western blotting测定FKN的表达水平。CCK-8检测细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:经对比,构建LV-FKN-RNAi阳性克隆序列与目的基因FKN相符;HK2细胞达到80%感染效率的最佳感染条件为:在enhanced infection solution(ENi.S)培养基中进行感染,设定感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10,感染时间为72小时。Western blotting结果显示,经筛选的HK2/LV-FKN-RNAi细胞中FKN基因表达水平降低(P<0.01)。细胞形态成梭形,多有伪足出现。CCK-8结果显示,与空白对照组相比,FKN基因敲低组细胞活力降低(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,与空白对照组相比,FKN基因敲低组细胞凋亡率增加(P<0.01)。结论:本研究成功构建一种低表达FKN基因的慢病毒载体;LV-FKN-RNAi感染HK2细胞后可实现目的基因的低表达,并且FKN基因敲低后HK2细胞活力下降,凋亡率增加。经筛选的HK2/LV-FKN-RNAi细胞株可用于后续实验研究。第二部分Fractalkine通过Wnt/β-catenin信号通路参与血管紧张素Ⅱ诱导的HK2细胞上皮-间质转分化的作用研究目的:本课题以Fractalkine(FKN)为研究的关键点,从体外细胞层面着手,深入探讨FKN在HK2细胞中的作用机制。通过体外细胞实验观察HK2细胞过表达FKN基因和低表达FKN基因后细胞中FKN、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙粘蛋白(E-cadherin)表达水平变化,及血管紧张素(Ang)Ⅱ、XAV939对HK2细胞的具体作用机制,探讨Wnt/β-cadherin信号通路在细胞上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用以及FKN对该信号通路的具体影响,深入了解FKN在HK2细胞中的作用机制,为防治狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)提供科学的理论依据。方法:以HK2细胞为研究对象,通过慢病毒低表达FKN载体和高表达FKN载体分别转染HK2细胞,细胞随机分为9组:1)正常对照组;2)FKN-KD组;3)XAV939组;4)FKN-KD+VAV939组;5)Ex-FKN组;6)Ex-FKN+VAV939组;7)AngⅡ组;8)FKN-KD+AngⅡ组;9)Ex-FKN+AngⅡ组。应用western blotting、q RT-PCR验证两组细胞内FKN、EMT相关因子、Wnt/β-cadherin信号通路表达水平变化;应用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。结果:FKN低表达下调HK2细胞中EMT、Wnt/β-catenin表达水平(P<0.01);与XAV939共同作用后EMT、Wnt/β-catenin表达水平显著下调(P<0.01),细胞凋亡率显著上调(P<0.01);FKN过表达上调HK2细胞中EMT、Wnt/β-catenin表达水平(P<0.01);与AngⅡ共同作用后EMT、Wnt/β-catenin表达显著提高(P<0.01),细胞凋亡率显著下调(P<0.01)。结论:FKN介导AngⅡ可能通过调控Wnt/β-catenin信号途径诱导HK2细胞上皮-间质转分化的发生。第三部分Fractalkine通过Wnt/β-catenin信号通路参与狼疮小鼠肾上皮-间质转分化的作用研究目的:通过研究FKN在狼疮模型MRL/lpr小鼠肾脏病理学改变中的具体作用,探讨FKN通过调控Wnt/β-catenin信号通路在狼疮模型MRL/lpr小鼠肾上皮-间质转分化中的作用机制。方法:选取15只12周龄雌性MRL/lpr小鼠,随机分为4组:rFKN组,每天给予Recombinant Mouse CX3CL1/Fractalkine Chemokine Domain腹腔注射;Anti-FKN组,每天给予Mouse CX3CL1/fractalkine Chemokine Domain Antibody腹腔注射;Ig G组,每天给予Rat Ig G2A Isotype Control腹腔注射;空白对照组,每天给予生理盐水腹腔注射,7天后收集各组小鼠外周血,24小时尿蛋白,取肾皮质。酶联免疫吸附检测各组小鼠体内ANA、anti-ds DNA、anti-Sm抗体水平,应用q RT-PCR、western blotting检测FKN、EMT、Wnt/β-catenin相关因子m RNA和蛋白表达水平,通过六胺银染色(Periodic Acid-silver Methe-namine,PASM)染色观察肾组织病理改变,免疫组织化学染色法检测肾皮质FKN、EMT、Wnt/β-catenin相关蛋白的表达。结果:与空白对照组相比,rFKN组小鼠ANA、anti-ds DNA、anti-Sm表达水平显著增高(P<0.01),尿蛋白水平增加(P<0.01),肾脏炎症病变加重,FKN、wnt-4、Vimentin、α-SMA、CCL22、F4/80、TGFβ、NF-κB-p65蛋白和m RNA表达水平显著增加(P<0.01),E-cadherin蛋白和m RNA表达水平显著降低(P<0.01)。Anti-FKN组小鼠ANA、anti-ds DNA、anti-Sm表达水平显著降低(P<0.01),尿蛋白水平下降(P<0.01),肾脏炎症病变明显改善,FKN、wnt-4、Vimentin、α-SMA、CCL22、F4/80、TGFβ、NF-κB-p65蛋白和m RNA表达水平显著下降(P<0.01),E-cadherin蛋白和m RNA表达水平显著增高(P<0.01)。结论:FKN可能通过Wnt/β-catenin信号途径诱导狼疮模型MRL/lpr小鼠肾上皮-间质转分化的发生。