第一部分缺氧诱导黑色素瘤细胞发生老化[目的]利用老化相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色,检测C57小鼠黑色素瘤细胞是否会发生老化,观察细胞老化发生部位的特殊性并推测老化发生诱因。同时通过体外缺氧模型诱导细胞老化,为进一步了解肿瘤细胞在特殊微环境中反应特点及其发生意义奠定研究基础。[方法]C57BL/6J小鼠皮下接种B16细胞,获取黑色素移植瘤后石蜡包埋或冰冻切片。利用肿瘤组织冰冻切片SA-β-gal染色判断细胞老化发生情况。免疫组织化学染色endomucin分析肿瘤组织中血管分布及其和老化发生的空间位置关系。缺氧探针(pimonidazole)染色观察组织中缺氧和老化的联系。建立体外缺氧诱导老化模型。利用Western Blot判断HIF-1α表达与老化的关系。[结果]1)小鼠黑色素瘤组织冰冻切片SA-β-gal染色发现阳性的肿瘤细胞核周胞浆蓝染,细胞核固缩,多分布在坏死区域周边。2)缺氧探针和血管内皮染色证实坏死周边区域细胞处于缺氧状态并且超出了血管供应范围。3)利用CoCl2和GasPak缺氧袋模拟缺氧可以诱导B16和A875细胞发生老化(SA-β-gal阳性);当脱离缺氧环境后,细胞仍维持在老化状态。4)缺氧处理后细胞HIF-1α表达升高而恢复至常氧后其表达降低。[小结]1)在缺氧微环境中,肿瘤细胞发生老化;2)体外缺氧模型可以诱导细胞发生不可逆的老化反应;3)缺氧诱导的老化细胞状态维持不依赖HIF-1α表达。第二部分老化细胞调节肿瘤微环境[目的]分析老化细胞MMP-2表达分泌水平以及对细胞侵袭、血管迁移和塑性能力的影响,以证实老化细胞具有的特殊分泌表型可以调控肿瘤微环境。通过对70例随访资料完全的人恶性黑色素瘤临床标本进行分析,判断肿瘤组织中坏死/溃疡的存在与患者临床预后的关系。[方法]利用CoCl2模拟缺氧诱导细胞老化,通过Western blot和明胶酶谱法分析老化细胞MMPs表达分泌水平;通过Transwell侵袭实验评价老化细胞培养基对肿瘤细胞侵袭能力和内皮细胞迁移能力的影响;进一步利用Matrigel三维培养模型分析老化细胞对内皮细胞管道化塑形能力的影响。通过对小鼠及人黑色素瘤组织MMP-2免疫组织化学染色,计数MMP-2表达情况以及MMP-2表达特点,进行统计学分析。收集天津医科大学附属肿瘤医院1996年1月至2007年10月期间经手术切除标本随访资料完整并经病理医师诊断为恶性黑色素瘤的病例70例,对临床病历资料和随访资料进行分析;利用HE染色观察70例恶性黑色素瘤组织中坏死/溃疡存在,分析坏死/溃疡与临床预后的关系,进行统计学分析。[结果]1)老化细胞MMP-2表达和活性增高;来源于老化细胞的条件培养基增强细胞侵袭能力和管道塑形能力。2)70例恶性黑色素瘤临床病例样本中,有32例存在坏死/溃疡;生存分析结果表明存在坏死/溃疡的病例其生存时间较短;Cox回归分析结果表明当把坏死和溃疡视为同一组织学改变分析时,可以作为独立的影响预后因素。[小结]1)老化细胞通过分泌MMP-2调节细胞外基质影响周边细胞生物学行为。2)存在坏死/溃疡的黑色素瘤病人生存预后差,这可能与发生在坏死/溃疡周边的老化细胞调节肿瘤微环境相关。第三部分成纤维细胞老化对黑色素瘤的影响[目的]研究C57同源性小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)与B16混合接种对移植瘤生长的影响。检测混合接种移植瘤中成纤维细胞以及体外多次MEF传代后老化发生情况。观察老化的MEF对血管内皮细胞增殖能力和血管内皮相关蛋白表达的影响。同时检测炎症因子IL-6是否参与到老化对肿瘤生长促进的作用中。为进一步了解在与肿瘤细胞接触的微环境中MEF发生老化及其对肿瘤进展的影响,为肿瘤实质与间质相互作用研究提供依据。[方法]1)原代培养C57小鼠胚胎成纤维细胞,免疫荧光鉴定Vimentin表达确定细胞类型。将MEF多次传代,检测MEF老化发生及老化的MEF培养基对血管内皮细胞增殖和相关蛋白表达的影响。利用酶联免疫吸附法(ELASA)检测老化MEF分泌IL-6情况。2)将B16与MEF按1:2比例混合共同接种于C57小鼠皮下,观察肿瘤生长情况;利用SA-β-gal染色检测肿瘤组织中细胞老化的发生;通过免疫组织化学染色检测老化成纤维细胞IL-6表达水平。3)分析70例人黑色素瘤组织IL-6表达与各临床指标关系。[结果]1)多次传代后,MEF发生老化比例明显增高;血管内皮细胞在老化MEF条件培养基增殖能力增强而且VEGFR2表达增高;早期传代MEF相比,老化MEF的IL-6分泌水平增高。2)来源于B16和MEF混合接种的小鼠黑色素移植瘤组织结构发生改变:肿瘤间质成分增多并包绕肿瘤实质细胞,组织坏死面积减少,微血管增多;MEF发生老化并分泌IL-6。3)统计分析显示人黑色素瘤组织IL-6表达与患者高年龄和高微血管密度相关。[小结]1)成纤维细胞促进肿瘤生长,且肿瘤间质成纤维细胞发生老化。2)老化成纤维细胞通过影响血管生成促进肿瘤生长。2)炎症因子IL-6可能参与老化发生及其对血管新生的作用。结论1.发生老化的黑色素瘤细胞主要分布在肿瘤组织坏死周边的缺氧区域,而且体外氯化钴模拟缺氧环境有效地诱导了黑色素瘤细胞老化发生,而不能耐受缺氧的细胞发生死亡,因此缺氧可以诱导体内/外黑色素瘤细胞老化;2.缺氧环境中老化细胞虽然生长停滞但仍保持代谢活性,通过其特殊分泌表型高表达基质金属蛋白酶MMP-2,影响肿瘤细胞侵袭和内皮细胞迁移能力;3.分布在缺氧环境中坏死周边老化细胞对肿瘤微环境的改造作用和人黑色素瘤组织存在坏死/溃疡患者预后不良有关;4.小鼠成纤维细胞(MEF)多次传代后发生老化并具有特殊分泌功能;其IL-6分泌水平增高,通过影响血管生成从而促进肿瘤生长。