研究目的：本研究通过心衰大鼠心肌线粒体亚群及其线粒体内膜的制备,运用定量蛋白组学的研究方法—iTRAQ,开展基于心衰心肌线粒体亚群内膜蛋白生物学改变的全面系统研究,掌握心衰心肌线粒体内膜蛋白病理性表达的概况及其SSM、IFM亚群内膜蛋白的潜在生物学表达异质性；并结合线粒体蛋白转运功能的测定,探索心衰心肌线粒体内膜蛋白的病理性表达机制,为心衰心肌线粒体相关病理机制的深入挖掘以及心复康口服液等中药抗心力衰竭的疗效机制研究开拓新视角新方向。研究方法：1.心肌梗死后心衰模型大鼠心功能的测定：应用血液动力学技术测定大鼠LVSP. LVEDP、±dp/dtmax,心脏超声技术测定大鼠SV、EF、LEVDD、LEVDS,并计算CO；2.心肌梗死后心衰模型大鼠心肌线粒体亚群的形态及超微结构观察：应用可与完整线粒体结合的Mito Tracker deep red 633标记心肌线粒体亚群样品,采用流式细胞术检测大鼠心肌线粒体亚群的完整性、大小及内部复杂性等形态学参数,结合透射电镜技术观察心肌线粒体亚群超微结构；3.心衰模型大鼠心肌线粒体内膜蛋白介导的线粒体功能学检测：运用Clark氧电极技术通过线粒体氧耗量测定线粒体呼吸功能,流式细胞术检测线粒体膜电位及mPTP,分光光度计测定线粒体内膜呼吸链复合物Ⅰ-Ⅳ及ATP合酶(复合物V)的活性；4.心衰模型大鼠心肌线粒体内膜能量代谢亚组蛋白质组学研究：制备纯化心肌线粒体内膜蛋白样品,运用iTRAQ技术对心肌线粒体内膜蛋白样品进行蛋白质组学研究,并对鉴定出的蛋白质进行功能学解释,筛选差异蛋白并予以Western Blot验证；5.心衰模型大鼠心肌线粒体蛋白转运功能评价：应用Western Blot法测定线粒体蛋白转运功能相关蛋白表达水平,以间接评价心衰模型大鼠心肌线粒体蛋白转运功能,探索心衰模型大鼠心肌线粒体内膜蛋白的病理性表达机制。研究结果：1.心复康对心衰大鼠心功能损伤的干预作用建立心梗后心衰动物模型并予以药物干预8周后,与假手术组相比,模型组SV、 EF均显著降低,且LVIDd、LVIDs明显升高；与模型组比较,曲美他嗪、心复康大剂量组的SV、EF较模型组显著增加(P<0.05)；且与假手术组比较,模型组呈现心率加快、CO降低等病理变化,卡托普利、曲美他嗪及心复康大小剂量等药物干预组较模型组心率及心输出量均有缓解趋势。模型制备并药物干预8周后,卡托普利、曲美他嗪及心复康大剂量可显著改善LVSP、 +dp/dtmax及-dp/dtmax的病理性降低,并可不同程度地降低LVEDP,其中卡托普利、曲美他嗪及心复康大剂量组的降低趋势具有极显著的统计学差异(P<0.01)。2.心复康对心衰大鼠心肌线粒体亚群形态及超微结构的影响结合Mito Tracker deep red 633标记的线粒体完整性流式细胞术检测与线粒体电镜超微结构观察,结果提示线粒体分离流程较稳定可靠,可获得完整且纯度较高的心肌心肌线粒体亚群。基于Mito Tracker deep red 633标记的线粒体形态学流式细胞术检测结果表明,假手术组中,与SSM比较,IFM体积较小且内部复杂性较高。模型组IFM与假手术组比较,体积增大且内部复杂性降低(P<0.01),模型组SSM的大小及内部复杂程度无明显病理改变。与模型组比较,心复康大剂量组心肌IFM的体积显著减小(P<0.01),且卡托普利组、曲美他嗪组及心复康大剂量组心肌IFM的内部复杂性显著增加(P<0.01；P<0.05；P<0.01),提示心衰心肌线粒体亚群形态学改变的异质性,且IFM亚群的形态学损伤体现为体积增大及内部复杂性降低。通过透射电镜观察各组心肌线粒体亚群的超微结构,结果显示,假手术组线粒体亚群形态规则。其中,IFM亚群线粒体大小较整齐,线粒体排列趋于紧密,嵴形态包含板层状与管泡状结构；SSM亚群线粒体大小不一,线粒体排列较疏松,线粒体嵴多为薄片状。模型组IFM亚群线粒体体积增大,外室肿胀伴内室肿胀,基质电子密度较低且出现多个局灶性空泡,嵴排列紊乱,移向周围,变短、融合且数量减少,嵴连接部位存在断裂,线粒体排列较假手术组稀疏；而模型组SSM亚群线粒体体积、肿胀度及嵴结构未见明显变化,排列较假手术组致密。卡托普利、曲美他嗪及心复康大小剂量可不同程度地改善IFM亚群的线粒体肿胀、嵴移位等病理改变。3.心复康对心衰大鼠心肌线粒体亚群内膜蛋白介导线粒体功能的影响以谷氨酸和苹果酸为底物,测定NADH氧化呼吸链的氧化磷酸化功能；以琥珀酸为底物、鱼藤酮抑制NADH->CoQ的电子传递,测定FADH氧化呼吸链的氧化磷酸化功能。与假手术组比较,模型组心肌线粒体亚群的NADH氧化呼吸链及FADH氧化呼吸链的线粒体呼吸功能均降低,表现为IFM亚群的NADH氧化呼吸链损伤较著(P<0.01)及SSM亚群的FADH氧化呼吸链损伤较著(P<0.01)为特点。与模型组比较,卡托普利组、曲美他嗪组及心复康大小剂量组的线粒体亚群呼吸功能均不同程度地增强,尤以ATP合成相关指征P/O、OPR的升高为著。与假手术组相比,模型组心肌线粒体亚群氧化磷酸化相关复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的酶活性均出现不同程度地下调,尤以IFM亚群的cⅠ、CⅣ降低明显(P<0.01),但卡托普利与心复康大剂量干预可显著提高IFM亚群复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的酶活性,同时改善病理性下调的△(?)m(P>0.05)及持续性通透性增加的mPTP(P<0.05)。4.心复康对心衰大鼠心肌线粒体亚群内膜蛋白生物学表达的影响经MALDI-TOF/TOF质谱分析及数据库检索,心肌线粒体各亚群分别检索出413个蛋白(IFM)和502个蛋白(SSM),经统计学分析和差异倍数过滤标准的筛选,鉴定出IFM的差异表达蛋白76个,均为表达下调。其中,与模型组比较,心复康大剂量组上调表达差异蛋白76个；心复康小剂量组上调表达差异蛋白24个；卡托普利组上调表达差异蛋白2个,下调表达1个；曲美他嗪组上调表达差异蛋白1个,下调表达8个。SSM的差异表达蛋白1个,蛋白表达上调。以IFM亚群为研究对象,在鉴定筛选出的76个差异蛋白中,包含线粒体内膜的氧化磷酸化相关蛋白(55个)、转运蛋白(9个)、内膜结构相关蛋白(5个)、蛋白转入家族蛋白(4个)、融合相关蛋白(2个)、DNA合成相关蛋白(1个)与内膜成分心磷脂结合及生物合成相关蛋白(各1个)(以上含有部分跨功能蛋白),涉及线粒体的内膜结构维持与氧化磷酸化供能、钙调节、蛋白转运、线粒体动力学等多重生物学功能。基于模型组病理性表达的差异蛋白,选取具指导意义的线粒体SSM与IFM亚群异质性表达蛋白ATP5J、线粒体内膜结构相关蛋白MICOS complex subunit Mic60 (Mitofilin)及兼具线粒体动力学相关融合功能蛋白Coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 3(Chchd3)作为目标蛋白予以Western Blot验证,结果显示其各组表达情况与蛋白质组学分析结果基本一致。5.心复康对心衰大鼠心肌线粒体亚群蛋白转运功能相关蛋白表达的影响结果显示,模型组心肌SSM及IFM亚群的Tom40、Tim22、Tim23表达水平均呈现不同程度地表达下调,尤以IFM亚群的Tim23蛋白表达下调显著,且与模型组比较,心复康大小剂量组、卡托普利组与曲美他嗪组的心肌IFM亚群Tim23蛋白表达均趋于上调。研究结论：1.心复康口服液可显著提高心衰模型大鼠的每搏输出量,减轻左心室内压,改善心肌舒缩功能；2.心衰模型大鼠心肌线粒体形态及超微结构损伤以IFM亚群为著,且心复康口服液能明显缓解IFM亚群的病理性形态结构改变；3.心衰模型大鼠心肌线粒体IFM亚群的氧化磷酸化功能显著受损,且心复康口服液可在一定程度内改善心衰心肌线粒体内膜蛋白介导的氧化磷酸化功能紊乱；4.心衰模型大鼠心肌线粒体内膜蛋白的病理性表达主要位于IFM亚群,而心复康口服液可显著上调IFM内膜上的线粒体融合蛋白、内膜结构相关蛋白、氧化磷酸化功能蛋白及线粒体蛋白转运机制相关蛋白,提示其干预机制可能为通过改善心肌线粒体动力学使线粒体自适应性修复能力增强,启动线粒体内膜结构的损伤修缮、促进氧化磷酸化机能恢复、膜电位稳定以及蛋白转运功能正常等一系列良性循环调节,改善心力衰竭心肌的能量代谢障碍；5.心衰心肌线粒体亚群存在线粒体内膜蛋白的转运机制障碍,而心复康口服液可上调心肌IFM亚群的Tim23表达水平,提示心复康对心衰心肌线粒体内膜蛋白病理性生物学表达的良性干预作用可能是通过改善心衰心肌线粒体的内膜结构及内膜靶向蛋白的线粒体蛋白转运功能实现的。