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【目的】无机砷是确认的人类致癌物,慢性砷暴露可以导致皮肤癌和肺癌的发生。然而由于目前砷致癌动物模型尚未建立成功,其机制研究长期滞后。氧化应激假说与细胞增殖、凋亡异常是砷致癌机制的热点假说。一系列研究表明无机砷慢性染毒可促进细胞增殖,诱导多种细胞发生恶性转化,然而砷诱发细胞恶性转化的具体机制仍有待阐明。本课题以长期亚砷酸钠（NaAsO2）染毒人肺支气管上皮细胞（HBE）和人皮肤角质形成细胞（HaCaT）恶性转化模型为研究基础,研究细胞增殖,细胞周期,细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶的动态变化,进一步探讨导致细胞增殖,发生恶性转化的具体分子机制。对研究砷致癌机制和提供砷中毒防治新思路具有一定理论意义和实际应用价值。【方法】1.NaAsO2致HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中（HBE包括0、1、8、15、22、29、36、43代,HaCaT细胞包括0、1、7、14、21、28、35代）,细胞增殖相关指标:采用MTT实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞周期;采用western blot实验检测细胞总蛋白中细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、cyclin A和细胞周期依赖激酶CDK2的表达水平。2.NaAsO2致HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中（HBE细胞包括0、1、8、15、22、29、36、43代,HaCaT细胞包括0、1、7、14、21、28、35代）,Nrf2-NQO1信号通路相关指标:采用western blot实验检测细胞总蛋白中Nrf2、NQO1蛋白的表达水平,不同浓度过氧化氢处理后采用MTT检测转化细胞（HBE细胞43代,HaCaT细胞35代）的存活率。3.Nrf2-siRNA转染HBE和HaCaT转化细胞（HBE细胞43代,HaCaT细胞35代）后各指标的检测:采用western blot实验检测细胞总蛋白中Nrf2、NQO1蛋白的表达水平,不同浓度过氧化氢处理后采用MTT检测细胞的存活率,采用软琼脂克隆实验检测克隆形成能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用MTT实验检测细胞增殖能力;采用流式细胞仪检测细胞周期变化;采用western blot实验检测细胞总蛋白中细胞周期蛋白cyclin E和细胞周期依赖激酶CDK2的表达水平。4.NQO1-siRNA转染HBE和HaCaT转化细胞（HBE细胞43代,HaCaT细胞35代）后各指标的检测:采用western blot实验检测细胞总蛋白中Nrf2、NQO1蛋白的表达水平,不同浓度过氧化氢刺激后采用MTT检测细胞的存活率,采用软琼脂克隆实验检测克隆形成能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用MTT实验检测细胞增殖情况;采用流式细胞仪检测细胞周期变化;采用western blot实验检测细胞总蛋白中细胞周期蛋白cyclin E和细胞周期依赖激酶CDK2的表达水平。【结果】1.NaAsO2诱导HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中,对细胞增殖相关指标进行检测发现:随着染毒代数增加,HBE细胞相对增殖率在36代及以后出现升高趋势;HaCaT细胞相对增殖率在21代及以后出现升高趋势。同时,HBE细胞22、43代细胞G1期细胞比例减少,29、36代G2/M期细胞比例发生改变,8、29、36、43代S期细胞比例明显增加。而在HaCaT细胞中,与传代对照组相比,染砷组HaCaT细胞G1期细胞比例明显减少、S期细胞比例明显增多。cyclin E蛋白表达在HBE细胞中,8代以后出现升高趋势,22代及以后呈现持续性高表达。而HaCaT细胞中cyclin E蛋白表达在7代以后呈现逐渐上升趋势,14代及以后呈现持续性升高趋势;cyclin A和cyclin D1蛋白表达在HBE和HaCaT细胞中均无统计学意义的改变。HBE细胞中CDK2蛋白表达在8代开始呈现显著升高趋势,29代及以后呈现持续升高趋势;而HaCaT细胞中CDK2蛋白表达在14代以后呈现显著上升趋势。2.NaAsO2诱导HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中,对Nrf2-NQO1信号通路相关指标进行检测发现:HBE细胞中Nrf2蛋白表达在8代开始呈现显著升高趋势,29代及以后呈现持续升高趋势;而HaCaT细胞中Nrf2蛋白表达在8代以后呈现逐渐上升趋势,21代以后呈现明显升高趋势。NQO1蛋白表达在HBE细胞中,8代及以后呈现逐渐升高趋势;HaCaT细胞中,NQO1蛋白表达在1代出现上升,21代及以后呈现持续升高趋势。转化T-HBE细胞在0.4、0.6、0.8mmol/L过氧化氢预处理48h后细胞存活率明显升高;而T-HaCaT细胞在0.4mmol/L过氧化氢预处理后,相较转染对照组HaCaT细胞,细胞存活率明显上升。3.Nrf2-siRNA处理HBE和HaCaT恶性转化细胞,对各指标进行检测发现:转染组细胞中Nrf2、NQO1蛋白表达较转染对照组均降低,且差异具有统计学意义（p<0.05）;用0.4、0.6mmol/L过氧化氢预处理48h后,转染组HBE细胞存活率低于转染对照组HBE细胞;转染组HaCaT细胞在0.2、0.4mmol/L过氧化氢预处理48h后,存活率低于转染对照组HaCaT细胞;转染组HBE和HaCaT细胞迁移率、相对增殖率、锚着独立性均低于转染对照组细胞;同时,转染组细胞G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低;cyclin E和CDK2蛋白表达较转染对照细胞均降低。4.NQO1-siRNA处理HBE和HaCaT恶性转化细胞,对各指标进行检测发现:转染组细胞中Nrf2表达无改变,而NQO1蛋白表达较转染对照组细胞均降低;用过氧化氢预处理48h后,转染组细胞存活率均低于转染对照组细胞;转染组HBE和HaCaT细胞迁移率、相对增殖率、锚着独立性均低于转染对照细胞;同时,细胞G0/G1期细胞比例升高,S期细胞比例降低;cyclin E和CDK2蛋白表达较转染对照细胞均降低。【结论】1.NaAsO2长期暴露致HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中伴随着细胞增殖加快,细胞周期进程出现G0/G1期跃迁至S期,cyclin E-CDK2复合物表达逐渐上升。2.NaAsO2长期暴露致HBE和HaCaT细胞恶性转化过程中出现Nrf2-NQO1信号通路活化,细胞抗氧化能力增强。3.抑制Nrf2或NQO1基因的表达能够降低cyclin E-CDK2的表达,S期细胞比例下降,降低细胞增殖速度,最终减轻恶性程度。4.Nrf2-NQO1信号通路可能是NaAsO2致使HBE和HaCaT细胞发生恶性转化的原因,其可能的机制是通过上调cyclin E-CDK2的表达,加速细胞周期和细胞增殖。