【摘 要】
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根结线虫危害非常严重,给农业生产上带来许多棘手的防治问题。目前采取传统方法防治根结线虫病效果不明显,随着基因工程技术日趋成熟,利用分子生物技术防治根结线虫病已成为
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根结线虫危害非常严重,给农业生产上带来许多棘手的防治问题。目前采取传统方法防治根结线虫病效果不明显,随着基因工程技术日趋成熟,利用分子生物技术防治根结线虫病已成为努力方向。植物根结内根结线虫对巨型细胞的建立起着关键性调控作用,巨型细胞为根结线虫的生长发育提供所需的营养。根结线虫侵染寄主植物中后期,巨型细胞内含物出现明显空泡化现象,但空泡化的具体机理不清楚。本研究以番茄作为对象对巨型细胞进行研究,为揭示根结线虫诱导寄主产生巨型细胞凋亡特征打下基础。主要创新性结果如下:1、揭示了雌根结线虫在寄主根组织里侵染位置。利用次氯酸钠-酸性品红染色法对南方根结线虫侵染后的番茄与空心菜根组织进行染色,测量根结中雌根结线虫中轴线与根组织中柱二者之间的角度。结果表明:在番茄与空心菜根结中,雌根结线虫中轴线与根组织中柱的侵染角度主要集中在40°~60°。2、优化了植物根结石蜡切片包埋角度。根据空心菜与番茄根结膨大形态特点及雌根结线虫侵染角度的测量结果,将根结形态为一边膨大的根结,采用向其膨大的反方向倾斜45°放置在蜡液中,使植物根组织中柱与长方形包埋模具的长边相交约45°,进行石蜡切片制作;获得不同侵染天数番茄根结最佳切片序列号,每个根结切片大约共切220刀,统计结果表明:其中220刀切片中1刀~90刀和151刀~220刀几乎不会出现巨型细胞以及根结线虫虫体,而91刀~150刀会逐渐出现巨型细胞以及根结线虫虫体,在每个根结切片总刀数的中位置前后10刀左右(切片中位置=总刀数/2),能够切到完整的根结线虫虫体,巨型细胞的个数达到最多。3、揭示了番茄根结内巨型细胞凋亡过程。侵染7DPI、14 DPI和21 DPI时,巨型细胞及其内含物的面积随侵染天数的增加逐渐增大,在21 DPI时巨型细胞及其内含物面积分别达到最大值10523.3±1562.9μm2和9929.3±1300.6μm2,从侵染21 DPI后内含物的面积开始减少,开始出现空泡化;随后巨型细胞及其内含物的面积随侵染天数的增加逐渐减小,在侵染35 DPI时出现空泡化明显,巨型细胞及其内含物的面积分别达到最小值7613.9±790.1μm2和4933.6±719.3μm2。利用TUNEL技术,检测不同侵染天数番茄根结组织中细胞凋亡率。结果也表明:处理组中绿色荧光信号随着侵染天数的增加而不断增多,细胞核凋亡率在侵染35 DPI达到最高,凋亡率为89%。以上结果综合表明,根结线虫通过二龄幼虫侵入寄主番茄根系后,巨型细胞经历发育-成熟-凋亡的过程。4、探明了与根结巨型细胞凋亡相关的根结线虫MiPDCD6基因和番茄Le MYB330基因表达特征。利用实时荧光定量PCR技术检测不同侵染天数根结线虫MiPDCD6基因和番茄LeMYB330基因表达量。发现:MiPDCD6基因在南方根结线虫侵染番茄21DPI时表达量最高;番茄Le MYB330基因在生长后期35 DPI时表达量最高。利用免疫荧光技术在不同侵染天数番茄根结切片中定位根结线虫MiPDCD6蛋白,结果显示:侵染21 DPI的根结切片中巨型细胞内部出现绿色荧光颗粒最多,荧光信号最强。以上结果综合表明,根结线虫MiPDCD6基因在巨型细胞刚开始发生凋亡现象时(侵染21 DPI)分泌量最多,荧光信号达到最强。
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