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第一部分组蛋白乙酰化在氯化锰诱导神经细胞Nrf2表达和修饰中的作用目的本实验以PC12细胞为多巴胺能神经细胞模型,以组蛋白乙酰转移酶抑制剂(HATs)漆树酸(anacardic acid,AA)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)为预处理试剂,观察锰诱导神经细胞Nrf2蛋白和m RNA的表达水平以及Nrf2的乙酰化水平,探讨组蛋白乙酰化与锰诱导神经细胞Nrf2表达的关系。方法用8.5μM AA预处理PC12细胞1 h或100 ng/ml TSA预处理PC12细胞6 h后,再分别用0、100、300μM氯化锰处理细胞24 h,提取细胞核蛋白/质蛋白后用免疫印迹检测Nrf2的蛋白表达水平;提取总m RNA,用实时定量RT-PCR检测Nrf2 m RNA的表达水平;提取细胞总蛋白后用免疫沉淀纯化Nrf2后用免疫印迹检测Nrf2的自乙酰化表达水平。结果(1)(1)0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h,结果:与生理盐水组比较,300μM氯化锰处理组的细胞核/质内的Nrf2蛋白表达水平有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),这些结果表明氯化锰可促进Nrf2蛋白在细胞核/细胞质中的表达。(2)TSA预处理6 h之后再用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h发现:A.与100μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用100μM氯化锰处理组的细胞核内的Nrf2蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);B.与300μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用300μM氯化锰处理组的Nrf2m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01),这些结果表明HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2蛋白核转位与Nrf2 m RNA的表达。(3)AA预处理1 h之后再用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h,结果:A.与生理盐水组比较,AA预处理再用生理盐水组的Nrf2 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);B.与100μM氯化锰处理组比较,AA预处理再用100μM氯化锰处理组的Nrf2 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);C.与300μM氯化锰处理组比较,AA预处理再用300μM氯化锰处理组的Nrf2 m RNA表达水平有显著升高,差异具有统计学意义(P<0.01),这些结果表明HATs抑制剂AA可促进锰对PC12细胞Nrf2 m RNA表达水平升高;(2)用8.5μM AA预处理PC12细胞1 h或100 ng/ml TSA预处理6 h后再分别用0、100、300μM氯化锰处理24 h,结果:与对照组相比较,各处理组的Nrf2赖氨酸残基乙酰化表达水平尚未见明显变化,差异不具有统计学意义(P>0.05)。这些结果尚不能说明HATs抑制剂AA、HDACs抑制剂TSA或氯化锰处理可影响PC12细胞内Nrf2乙酰化水平。结论在一定浓度的氯化锰处理下,HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2蛋白核转位;HATs抑制剂AA或HDACs抑制剂TSA预处理均可促进锰所致的Nrf2 m RNA的表达;尚不能说明HATs抑制剂AA、HDACs抑制剂TSA或氯化锰处理可影响PC12细胞内Nrf2乙酰化修饰。第二部分组蛋白乙酰化在氯化锰激活神经细胞Nrf2中的作用目的前期研究结果表明,HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2蛋白核转位。本实验以组蛋白乙酰转移酶抑制剂漆树酸(AA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)为预处理试剂,观察PC12细胞中Nrf2-ARE结合活性、Nrf2下游靶基因HO-1蛋白及m RNA的表达水平,进一步明确组蛋白乙酰化在锰激活神经细胞中Nrf2/HO-1通路中的作用。方法细胞分组与处理方式同第一部分。提取核蛋白用ELISA试剂盒检测Nrf2与ARE元件的结合活性;提取总m RNA用实时定量RT-PCR检测HO-1 m RNA的表达水平;提取细胞总蛋白用免疫印迹检测HO-1的蛋白表达水平。结果(1)用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h发现:与生理盐水处理组比较,100μM氯化锰处理组细胞核内的Nrf2与ARE的结合活性与HO-1蛋白表达水平升高,300μM氯化锰处理组的HO-1 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01),这些结果表明100μM氯化锰处理可使Nrf2与ARE元件的结合活性与HO-1蛋白表达水平均升高,300μM氯化锰处理可使HO-1 m RNA和HO-1蛋白表达水平均升高。(2)TSA预处理6 h之后再用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h发现:A.与100μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用100μM氯化锰处理组的细胞核内的Nrf2与ARE的结合活性、HO-1 m RNA表达水平和HO-1蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);B.与300μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用300μM氯化锰处理组的HO-1 m RNA表达水平和HO-1蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01),这些结果表明HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2与ARE元件的结合活性、HO-1 m RNA表达水平和HO-1蛋白表达水平均升高。(3)AA预处理1 h之后再用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h后发现:A.与100μM氯化锰处理组比较,AA预处理再用100μM氯化锰处理组的细胞核内的Nrf2与ARE的结合活性降低而HO-1 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);B.与300μM氯化锰处理组比较,AA预处理再用300μM氯化锰处理组的细胞核内的Nrf2与ARE的结合活性降低而HO-1 m RNA表达水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01)。这些结果表明HATs抑制剂AA预处理可抑制氯化锰所致Nrf2与ARE元件的结合活性升高和促进HO-1 m RNA表达水平升高。结论在一定浓度的氯化锰处理下,HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2与ARE元件的结合活性升高,而HATs抑制剂AA预处理可抑制氯化锰所致Nrf2与ARE元件的结合活性升高;HATs抑制剂AA或HDACs抑制剂TSA预处理都可促进氯化锰所致HO-1 m RNA的表达升高;HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致HO-1蛋白的表达升高。第三部分组蛋白乙酰化在氯化锰增加ROS生成和降低GSH水平中的作用目的前期研究结果表明,HDACs抑制剂TSA预处理可促进氯化锰所致Nrf2与ARE元件结合活性与HO-1蛋白表达水平升高。本实验以组蛋白乙酰转移酶抑制剂漆树酸(AA)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)为预处理试剂,观察PC12细胞的活性氧与还原型谷胱甘肽的改变,探讨组蛋白乙酰转移酶/去乙酰化酶抑制剂在氯化锰所致的氧化应激中活性氧(ROS)生成升高与还原型谷胱甘肽(GSH)的耗竭中的作用。方法细胞分组与处理方式同第一部分。收获细胞用荧光染料法(DCFH-DA)检测细胞活性氧的表达水平;超声破碎细胞后用微量酶标法检测细胞内还原型谷胱甘肽的含量。结果(1)用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h发现:与生理盐水组比较,100μM氯化锰处理组与300μM氯化锰处理组的活性氧水平升高,300μM氯化锰处理组的还原型谷胱甘肽含量降低,差异具有统计学意义(P<0.01),这些结果表明氯化锰处理可使活性氧水平升高和还原型谷胱甘肽含量降低;(2)TSA预处理6 h之后再用0、100、300μM氯化锰处理PC12细胞24 h,结果:A.与100μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用100μM氯化锰处理组活性氧水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01);B.与300μM氯化锰处理组比较,TSA预处理再用300μM氯化锰处理组GSH含量升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。这些结果表明HDACs抑制剂TSA预处理可抑制氯化锰所致活性氧水平升高和还原型谷胱甘肽的降低。结论在一定浓度的氯化锰处理下,HDACs抑制剂TSA预处理可抑制氯化锰所致活性氧水平升高与还原型谷胱甘肽的降低。