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南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)在水相和非水相介质中都表现出较高的催化活性,是应用最为广泛的生物催化剂之一,可以催化水解、酯化、聚合、转酯化等反应。CALB催化具有活性高、选择性好、反应条件温和、对环境友好以及催化底物谱广等优势,使其成为国内外研究的热点。目前它已广泛应用于手性药物中间体的拆分、酯类产品合成、油脂改性以及生物柴油合成等领域。关于南极假丝酵母脂肪酶B的结构、克隆与表达、固定化以及分子改造等研究已广泛开展。近来,对CALB进行定向进化和探索其新的应用正是研究的热点问题。本论文从实验室已构建成功的工程菌南极假丝酵母脂肪酶B(E.coli JM109/pPICZαA-CALB)出发,利用理性设计方法对其进行分子改造。对CALB的立体结构进行分析,发现其D134、1189、V190、V221、A281位点具有一定特殊意义。以pPICZαA-CALB载体为模板,设计兼并引物,采用质粒扩增诱变方法,对原始菌株进行D134、1189、V190位点的第一轮定点突变,然后在V190L的基础上进行第二轮221、281位点的饱和突变。突变后均获得约4500 bp的重组突变质粒库,最终导入毕赤酵母X-33中表达,重新构建得到毕赤酵母重组CALB 突变株(Pichia pastoris X-33/pPICZα A-CALBmut)。经过p-NPA法测定各突变脂肪酶的水解酶活,得到若干株活力提高的突变菌。选择对p-NPA水解活力提高最多的突变株D-4(A281G/V190L),对其进行分离纯化及酶学性质研究。研究结果表明D-4最适反应pH、温度分别为7.0、35℃,该酶在pH5～10范围内比较稳定,但对高温较为敏感。部分金属离子对酶活具有轻微促进作用,Mn2+几乎不影响此酶的活性,但Fe2+对酶具有完全抑制作用。除TritonX-100对酶活力有轻微的激活作用,其他表面活性剂(SDS、吐温-80、吐温-20、山梨醇)均抑制该酶的活性。选用四个突变菌株 V190L,281-1-1(A281T/V190L),281-11-2(A281V/V190L),D-4及原始菌株(WT)为研究对象,分别检测其在不同反应类型中的催化性能。突变前后CALB针对对硝基苯酚酯(p-NPs)的底物特异性水解研究中发现:D-4对短中链(C2-C6)的p-NPs水解活力最高,其中对p-NPB、p-NPA的水解活力分别比WT活力提高了 60倍、41倍,而281-1-1对长链p-NPs的水解活力最好。在酯化合成维生素A棕榈酸酯研究中,只有V190L活力提高了 145%,D-4酯化活力几乎没有发生改变。从水解拆分3-氰基-5-甲基-己酸酯研究中可知,突变菌的活力均有不同程度提高;突变菌除了对3-氰基-5-甲基-己酸甲酯的选择性有所降低外,对其他底物的选择性均有提高。WT对3-氰基-5-甲基-己酸正戊酯完全没有选择性,而D-4对其具有一定的选择性,E值达到12.8。