禽流感(Al)是由A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病。自1878年意大利首先发现至今,该病在全球范围暴发与流行。目前,高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza, HPAI)己被国际兽疫局规定为A类传染病。近年来,HPAI的暴发给养禽业造成巨大的经济损失,同时也严重威胁着人类的健康。免疫接种是预防流感发生的主要防治措施,但却无法通过血清学方法将自然感染群体从免疫群体中鉴别出来,从而限制了动物贸易,也不能够进行早期检测与控制。然而,使用异源NA亚型的标准灭活疫苗是有效的,这为在血清学上的鉴别诊断检测提供了可能,因此与之相应的鉴别诊断方法显得尤为重要。首先,依据Genbank中参考毒株(DQ201830.1)NA基因的核苷酸序列设计引物,以H5N1 AIV核酸物质为模板,通过RT-PCR反应获得约1.4Kb的基因片段,将该基因片段的测序结果与Genbank已报告的NA基因进行序列比较,发现与A/Goose/Huadong/1/2000(H5N1)毒株核苷酸的同源性为100%。将NA基因定向克隆至转移质粒pFastBacTMHTA的EcoRⅠ与PstⅠ之间的多克隆位点上。将鉴定为阳性的重组子,命名为pF-NA。将阳性pF-NA质粒转化感受态DH10Bac细胞,细胞内pF-NA与杆粒发生转座。筛选阳性克隆,提取重组杆粒,经过鉴定与纯化后转染昆虫细胞Sf9,96h后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA分子的PCR鉴定表明,获得了杆状病毒DNA与NA基因的重组子,命名为P1代病毒。反复感染Sf9细胞,扩增病毒,获得高滴度的P3代病毒,以备用于表达。将高滴度的P3代重组杆状病毒接种于形成50%单层的Sf9细胞,4d后收获病变细胞,应用SDS-PAGE、Western-blot和间接免疫荧光进行鉴定。SDS-PAGE、Western blot检测结果表明,有约52kD的融合蛋白得到表达,能与His单抗发生特异性结合,蛋白大小与理论值相符。间接免疫荧光结果表明,所表达的蛋白可被AIV H5N1亚型阳性血清所识别,具有与天然病毒蛋白一样的抗原特异性,并且表达的蛋白能够在Sf9细胞表面检测到。以真核表达系统表达的NA蛋白作为检测抗原,初步建立间接免疫荧光法(IFA)对血清抗体进行检测。本实验重点对影响IFA检测中病毒感染的MOI值、蛋白表达的最佳时间、细胞固定剂等条件进行探索。噬斑计数法测定P3代重组杆状病毒滴度为0.5×108pfu/ml。方阵滴定确定MOI =7;蛋白表达的时间为120h;细胞固定剂为4%的多聚甲醛。以H5N2亚型灭活苗免疫鸡群、未免疫鸡群及N1亚型自然感染鸡群的已知背景血清为待检血清,稀释溶度为1:20,作用时间为37℃1h;FITC标记的羊抗鸡IgG抗体为二抗,稀释浓度为1:60,作用时间为37℃0.5h。通过以上条件摸索,确立禽流感NA-IFA鉴别诊断方法。以此方法检测120份己知背景鸡血清,结果表明,该诊断方法特异性为100%,敏感性为98.3%。取8份抗体水平不同的血清样品在同一批试验中每份样品平行作3次(批内),又在3个不同试验日重复测定8份样品(批间),结果表明批内,批间检测的结果没有差异。说明此鉴别诊断方法重复性好。以相同的方法分别检测鸡新城疫、鸡传染性法氏囊、鸡传染性支气管炎的阳性血清,试验结果表明这3份血清全为阴性,表明该鉴别诊断方法的分析特异性好。以上结果表明NA-IFA检测方法特异、敏感且重复性好,可用于区分H5N2亚型禽流感疫苗免疫禽群与N1亚型野毒感染禽群。将本研究建立的禽流感病毒NA-IFA快速检测方法组装成诊断试剂盒。该试剂盒在4℃保存7 d、37℃保存2 d、- 20℃保存7个月的检测结果均稳定,鉴别结果均可靠。而且操作方便、经济、简单。以上试验及结果显示,利用禽流感病毒NA基因表达抗原,建立NA-IFA检测方法可以准确、快速地检测出抗N1抗体血清,并且能够与H5N2亚型灭活苗免疫鸡群血清区分开,这为相关执法部门确认是否属禽流感发生和采取截然不同处理方式提供重要依据。