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研究背景：阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD),又名老年性痴呆,是一种常见的神经系统退行性疾病,是痴呆最常见的类型。年龄增长和痴呆家族史是AD发病的两大危险因素。随着世界人口的老龄化,AD的患病率越来越高,带来沉重的社会经济负担,AD的防治已成为急待研究和解决的课题。AD病因发病机制不清,神经分子病理学研究β淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)发生错误折叠、聚集并沉积于老年斑是AD的主要病理标志,有关Aβ对神经元的毒性损害已成为AD研究的热点。近年研究提示胰岛素信号通路与Aβ代谢密切相关,且在AD患者神经元保护中扮演重要角色。中医学在痴呆的治疗方面有丰富的理论和许多有效方药,石菖蒲是治疗痴呆的常用中药之一,本课题前期研究已从体内和体外模型验证了石菖蒲主要活性成分β-细辛醚、丁香酚对AD的治疗作用,并在体内和体外模型中确立活性成分最佳配伍比例为4：1。本实验在前期研究基础上,进一步探讨石菖蒲活性成分4：1配伍对APPswe/PS1dE9双转基因鼠Aβ代谢和神经保护作用及其机制。目的：通过观察比较石菖蒲活性成分β-细辛醚、丁香酚4：1配伍药液以及β-细辛醚单体药液对APPswe/PS1dE9小鼠学习记忆、Aβ代谢的影响、胰岛素信号通路和神经凋亡的调控作用,探讨石菖蒲活性成分在配伍和单体形式下治疗AD的作用机制,同时探索β-细辛醚、丁香酚4：1配伍是否较β-细辛醚单体能起到“减毒增效”的作用,为开发防治AD的中药提供理论依据。方法：1.应用免疫组织化学法以及Tunnel法初步观察5月龄、7月龄和10月龄APPswe/PS1De9双转基因阳性小鼠Aβ1-42沉积与胰岛素生长因子受体IGF-1R、细胞凋亡变化的相关关系；2.SPF级雄性APPswe/PS1dE9双转基因阳性小鼠随机分为模型组、高剂量配伍组(84.8mg/kg·d; β-细辛醚：丁香酚=4：1),低剂量配伍组(42.4mg/kg·d; β-细辛醚：丁香酚=4：1),β-细辛醚单体组(84.8mg/kg· d),盐酸多奈哌齐(安理申4mg/kg·d)阳性药物对照组,每组19只。19只同龄同背景APPswe/PS1dE9转基因阴性鼠作为正常对照。正常组和模型组给予双蒸水灌胃。所有小鼠于5月龄开始灌胃治疗,1次／日,连续治疗5个月至10月龄；应用Morris水迷宫检测小鼠空间学习记忆能力,评价石菖蒲活性成分配伍对10月龄APPswe/PS1dE9双转基因小鼠认知功能的影响；3.运用western-blot蛋白测定方法观察APPswe/PSldE9双转基因小鼠治疗后脑皮质APP、BACE1、Aβ1-42蛋白的变化,采用免疫组化和硫磺素染色观察各组小鼠老年斑的变化,评价石菖蒲活性成分配伍对Aβ产生途径的影响；4.运用Western-blot方法观察APPswe/PS1dE9双转基因小鼠治疗后脑皮质胰岛素信号通路蛋白IGF-1R/p-IGF-1R、AKT/p-AKT和Bcl-2的变化,评价石菖蒲活性成分配伍对胰岛素信号通路的影响；采用TUNNEL凋亡检测法观察药物对细胞凋亡的影响。结果：1.免疫组化结果提示APPswe/PS1dE9转基因阳性小鼠5月龄即可见一定量老年斑沉积,7月龄、10月龄可见大量老年斑,10月龄与5月龄小鼠相比有统计学意义(P<0.05),部位以皮质部位为主；10月龄APPswe/PS1dE9转基因阳性小鼠IGF-1R蛋白表达与5月龄、7月龄小鼠相比,表达明显增多(P<0.05); Tunnel细胞凋亡提示细胞凋亡伴随小鼠月龄增长而增多；2. Morris水迷宫测试提示：与转基因阴性小鼠(正常组)相比,转基因阳性小鼠(模型组)在定位航行实验的游泳时间明显延长(P<0.05),空间探索模型组穿越平台次数较正常组明显减少(P<0.05)。与模型组相比,β-细辛醚组和高剂量配伍组在定位航行实验的游泳时间明显缩短(P<0.05)；高剂量配伍组与β-细辛醚组相比,各项行为学测试均未见统计学差异；3. Western-blot结果显示,和正常组相比,模型组小鼠APP、BACE-1和Aβ42蛋白表达量明显增高(p<0.05)；和模型组相比,各用药组有降低BACE-1和A β42蛋白表达的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)；免疫组化和硫磺素染色结果显示,模型组老年斑较正常组明显增多,各用药组未见明显差异；4. Western-blot检测显示,模型组较正常组IGF-IR蛋白明显增多,具有统计学意义(P<0.05),安理申组、细辛醚组和低剂量配伍组均较模型组IGF-IR明显降低,具有统计学意义(P<O.05)；各组p-IGF-1R、AKT/p-AKT蛋白表达未见差异(P>0.05)；和正常组相比,模型组小鼠Bcl-2蛋白表达量明显下降(P<0.05),和模型组相比,β-细辛醚组、低剂量配伍组和高剂量配伍组Bcl-2蛋白表达明显上调(P<0.05)；TUNNEL检测提示β-细辛醚组、低剂量配伍组和高剂量配伍组可明显减少细胞凋亡,(P<0.05)。结论：1.随年龄增长,转基因小鼠A β老年斑明显增多,伴随部分胰岛素信号转导通路蛋白表达异常,细胞凋亡表达出现较早,在5月龄转基因小鼠时已有表达；2.石莒蒲活性成分β-细辛醚单独使用剂量达到84.8mg/kg/d时,可有效改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力；石菖蒲活性成分配伍使用剂量达到84.8mg/kg/d时(含β-细辛醚67.84mg/kg/d,丁香酚16.96mg/kg/d)也可有效改善APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的学习记忆能力,但配伍组较单独使用B-细辛醚相比,并未显示出明显“减毒增效”的优势；3.石菖蒲活性成分β-细辛醚及其和丁香酚的配伍药液不能有效下调APPswe/PS1dE9双转基因小鼠Aβ1-42生成过程的相关蛋白表达；4.石菖蒲活性成分β-细辛醚及其和丁香酚的配伍药液不能改善胰岛素信号转导通路上游蛋白分子表达,但均可通过上调Bc1-2表达,减少细胞凋亡；5.石菖蒲活性成分配伍活性不能通过调节胰岛素信号转导通路干预Aβ代谢途径,但是可有效调节Bc1-2抑制神经元凋亡,改善学习记忆能力,该部分作用机制有待进一步深入研究。