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CIA2A(cytosolic Fe/S protein assembly machinery member 2A)亦称Fam96A,该蛋白包含160个氨基酸,大小为18.4kDa,编码该蛋白的基因位于15号染色体上。目前对CIA2A的研究较少,其可能具有的生物学功能为:CIA2A与CIAO1等蛋白结合形成Fe-S蛋白簇;通过调节WT1(Wilms tumor suppressor protein 1)的生物学功能,参与调节细胞的生长和分化等。Apoptin是鸡贫血病毒(chicken anemia virus,CAV)编码产生的一种含有121个氨基酸的小分子蛋白,分子量为13.6kDa。文献指出Apoptin仅在肿瘤细胞或转化细胞中具有促凋亡作用,而对人正常细胞不能产生凋亡效应,其亚细胞定位是决定特异性诱导细胞凋亡的关键因素之一,在肿瘤细胞和转化细胞内Apoptin是定位于细胞核的。本课题组前期研究成果发现:通过酵母双杂交实验筛选出CIA2A该蛋白质能够与Apoptin相互作用,并在正常细胞和肿瘤细胞中均证实了这一相互作用。临床组织标本的检测结果显示:肿瘤组织中,CIA2A低表达;正常组织中,CIA2A高表达。如前所述,Apoptin特异性诱导肿瘤细胞凋亡,而在正常细胞中Apoptin促凋亡活性被抑制。由此我们推测CIA2A与肿瘤细胞生长及Apoptin的肿瘤特异性诱导凋亡活性具有相关性。对此我们拟通过构建CIA2A不同肽段缺失的重组体,研究CIA2A在肿瘤细胞中对Apoptin诱导凋亡功能的影响及其与结构的关系。目的:研究CIA2A对子宫颈癌Hela细胞凋亡率的影响及其初步分子机制;研究CIA2A对Apoptin促Hela细胞凋亡活性的影响及其初步分子机制;研究CIA2A对Apoptin在Hela细胞中亚细胞定位的影响及其初步分子机制。方法:采用分子克隆技术,构建仅带myc标签的CIA2A不同肽段缺失的重组真核表达载体。依据CIA2A一级序列中的DUF59结构域构建3个重组体,分别为:CIA2A△1(缺失N端1-38氨基酸)、CIA2A△2(缺失DUF59结构域)和CIA2A△3(缺失C端119-160氨基酸)。将上述重组体分别单独转染至子宫颈癌Hela细胞中,利用流式细胞术检测CIA2A及其各缺失重组体对Hela细胞凋亡率的影响;将上述重组体和pcDNA3.1-flag-Apoptin质粒共同转染至Hela细胞中,利用流式细胞术检测CIA2A及其各缺失重组体在Hela细胞中对Apoptin诱导细胞凋亡作用的影响;免疫荧光技术检测CIA2A及其各缺失重组体对Apoptin在Hela细胞的亚细胞定位影响。结果:本实验成功构建了CIA2A不同肽段缺失的重组体。将CIA2A及其各缺失重组体单独转染、CIA2A及其各缺失重组体分别与Apoptin共同转染至Hela细胞中后,均能成功表达相应蛋白。CIA2A及其各缺失重组体分别单转至Hela细胞后,流式细胞术结果显示:CIA2A、CIA2A△1对Hela细胞具有促凋亡效应(凋亡率分别为46.5%、40.1%,P<0.01),而CIA2A△2和CIA2A△3没有该促凋亡作用(凋亡率分别为15.5%、13.8%,ns)。CIA2A及其各缺失重组体分别与Apoptin共转至Hela细胞中后,流式细胞术结果显示:CIA2A、CIA2A△2和CIA2A△3对Apoptin本身促Hela细胞凋亡活性均有抑制效果(凋亡率分别为38.4%、36.8%、32.5%,P<0.01),而CIA2A△1对Apoptin该活性没有明显影响(凋亡率为42.6%,ns);免疫荧光实验结果显示:全长的CIA2A、CIA2A△2,CIA2A△3能使原本应该定位于Hela细胞核的Apoptin转而定位于细胞质,CIA2A△1而不存在上述作用,Apoptin仍然位于细胞核中。结论:1.CIA2A对Hela细胞具有促凋亡效应,该功能对应肽段位于CIA2A△2和CIA2A△3所缺失的区域,即DUF59结构域和C端119-160氨基酸之间。2.CIA2A对Apoptin促Hela细胞凋亡活性有抑制作用,该功能对应肽段位于CIA2A△1所缺失区域,即N端1-38氨基酸之间。3.CIA2A可使原本应定位于Hela细胞核的Apoptin转而定位于细胞质,该功能对应肽段位于CIA2A△1所缺失区域,即N端1-38氨基酸之间。以上数据可为CIA2A的生物学功能研究充实新的资料,为将来Apoptin可能作为抗肿瘤药物的临床应用提供前期研究基础。