目的：　　 艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的一种严重传染病。　　 NK细胞是固有免疫应答中一类重要的效应细胞。它无需抗原预先刺激与活化，且不受主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制，即可直接对肿瘤或病毒感染细胞发挥杀伤作用。NK细胞根据其表面标志CD56/CD16的表达可分为CD56bright、CD56dim和CD56-CD16+三个亚群。由于NK细胞在机体早期防御HIV感染中发挥着至关重要的作用，近年来对于NK细胞的研究逐渐受到关注。然而，NK细胞在早期发挥抗HIV感染的同时，也受到HIV感染影响。在HIV感染过程中对NK细胞数量变化及功能变化的研究结果也不尽相同。早期有研究提示HIV感染的个体尽管NK细胞总数保持不变，但功能已受到损伤。而后期研究认为在HIV感染后NK细胞的数量和功能都下降，HAART治疗后NK细胞分泌IFN-r和CD107a的功能有所恢复(1-5)。有研究结果表明在HIV感染后，NK细胞亚群的分布也发生了改变。在HIV感染后，CD56dim亚群减少，该亚群是NK细胞亚群中数量最多、表型最成熟、杀伤功能最强的亚群，该功能亚群减少势必影响NK功能的发挥。那么是什么原因导致CD56dim的减少尚不清楚。在HIV感染后还发现CD56-CD16+亚群的增加，那么其增加的原因是什么也仍不清楚。除此之外，对于NK细胞亚群数量的报道多为百分数变化情况，然而百分数不能完全反应体内真实变化情况，其绝对数是如何变化的目前尚无报道。而且，关于HIV感染后NK变化的研究多为HIV慢性感染者，对于HIV早期感染NK细胞及其亚群变化情况的研究较少。据报道，MSM人群HIV感染后疾病进展较快，该人群的NK细胞及其亚群是如何变化的也鲜有报道。　　 本研究对HIV感染后NK功能及其亚群的变化进行研究，分析HIV感染后，细胞凋亡，增殖，活化及衰老等变化对NK及其亚群的影响，为进一步明确HIV感染后NK亚群变化的原因提供线索。　　 材料与方法：　　 1、研究对象　　 本研究共选取实验对象85例，其中，未接受过抗逆转录病毒治疗的HIV感染者29例，均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊的感染HIV的男男性接触人群。31例HAART治疗者，入选标准为经过严格的至少两年的HAART治疗后，HIV病毒RNA＜40copies/ml。25例正常对照组(HIV-negative normal control，NC)符合以下标准:HIV抗体阴性，血常规及肝肾功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性，无免疫系统疾病，未暴露于HIV的正常人。　　 2、CD4+T细胞和NK细胞绝对数检测　　 将20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂和CD3 FITC/CD56PE/CD16 PE/CD45 PerCP试剂分别加入绝对计数管中，每管分别用逆向加样法加入50μl混匀的抗凝全血，室温避光15min，每管加入1×免洗溶血素450t1，室温避光15min，应用FACS Calibur流式细胞仪进行检测，MultiSET软件分析结果，得到CD4+T淋巴细胞和NK细胞的绝对数。　　 3、NK细胞各亚群百分数、绝对数检测　　 200ul新鲜全血中加入4ml溶血素，10分钟后，离心，洗涤2次后加anti-CD3-FITC、anti-CD56-PEcy7、anti-CD16-APC荧光抗体，室温染色20分钟后，洗涤，使用BD LSRII流式细胞仪检测NK细胞各亚群百分比。计算其与该样本NK细胞绝对数的乘积即为NK细胞各亚群绝对数。　　 4、NK细胞活化、凋亡、增殖及衰老指标检测　　 每管200ul的肝素抗凝全血中加入4ml溶血素，10分钟后，离心，洗涤2次后加anti-CD3-FITC、anti-CD56-PEcy7、anti-CD16-APC荧光抗体进行NK表面染色和HLA-DR-PerCP、CD57-PE的活化和衰老标志染色;凋亡指标检测中，NK细胞表面染色20分钟，洗涤后进行Annexin-v、7AAD染色，15分钟后加入200ul凋亡洗液，直接在LSR上检测，该试验需在一小时内完成检测;NK细胞的核增殖活化水平检测是在标记出NK细胞后，破膜20分钟，用破膜洗液洗涤2次后进行胞内ki-67-PE染色。　　 5、NK细胞体外增殖能力检测　　 新鲜全血提取PBMC后进行细胞计数，用不完全1640调整细胞浓度为2million/ml，进行CFSE染色后37度避光孵育15分钟，冰上避光终止5分钟后，用完全1640洗涤2次，加入96孔培养板中，200ul/孔，刺激孔加入浓度为25ul/ml的IL-15，培养5天，三天时换液，培养5天后收集细胞，洗涤，进行NK细胞的表面染色，在LSR上检测NK的体外增殖情况。　　 6、NK细胞杀伤功能及细胞因子分泌功能检测　　 新鲜全血提取PBMC后进行细胞计数，按E:T分别为2∶1和16∶1调整K562细胞浓度，加入到PBMC中，在48孔板中刺激6小时，收集细胞后，洗涤一次，进行Annexin-v和7AAD染色，15分钟后在LSR检测K562细胞的凋亡情况。NK分泌功能为分选CD56dim和CD56-CD16+细胞亚群，rIL-12、rIL-15刺激，同时加入抗CD107a-PE和Brefeldin-A1ul/ml或Monensin0.7ul/ml，6小时后进行NK表面染色，洗涤后破膜10分钟，进行胞内IFN-r-APC染色，检测其分泌IFN-r。　　 7、HIV病毒载量测定　　 采用Roche公司The COBAS(R) AmpliPrep(R)/COBAS(R) TaqMan(R) HIV-1 Test试剂盒在COBAS(R)TaqMan(R)系统进行全自动PCR反应体系制备及病毒载量检测。　　 8、统计学分析　　 应用SPSS17.0软件包进行统计分析，所有数据以中位数表示，两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，P＜0.05为有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、HIV感染者及HAART治疗后NK细胞数量、表型及功能变化研究　　 1、HIV感染及HAART治疗后NK细胞百分数和绝对数变化　　 本研究对HIV感染者、HAART治疗者及NC进行CD3/CD56/CD16表面染色，检测NK细胞百分比及绝对数。结果显示:NK细胞百分比在三组中无明显差异，绝对数则在HIV组低于NC组(p=0.049)。 HAART治疗后NK细胞绝对数有所恢复，但无统计学意义。NK细胞的绝对数与病毒载量有负相关趋势。根据病毒载量高低分组:病毒载量≥104.5拷贝/ml组NK细胞绝对数低于载量低组(p=0.025)。　　 2、HIV感染及HAART治疗后NK细胞表型变化　　 本研究对HIV感染者、HAART治疗者及NC进行CD3/CD56/CD16表面染色及活化标志(HLA-DR)和凋亡标志(Annexin-v)染色，破膜后进行细胞核增殖活跃指标（ki-67）染色。结果显示:NK细胞在HIV组中活化指标高于NC组(p=0.015)。凋亡指标高于NC组(p=0.015)。细胞核活跃指标亦高于NC组(p=0.026)。　　 3、NK细胞体外增殖功能及杀伤功能变化　　 rIL-12、rIL-15刺激PBMC，5天后检测NK细胞增殖情况。结果显示:HIV组体外增殖能力低于NC组(p=0.042)。K562与PBMC共同孵育6小时后，检测PBMC对K562杀伤情况，结果显示:HIV感染组PBMC杀伤K562能力低于NC组(p=0.043)。　　 二、HIV感染后NK亚群的异常变化研究　　 1、HIV感染后CD56bright亚群数量、表型及功能变化情况　　 本研究对CD56bright亚群百分数、绝对数的检测结果显示:HIV组CD56bright的百分数与NC组无差异，但显著低于HAART组(p=0.015)，绝对数均低于NC和HAART组(p=0.018，p=0.000)，且都与感染时间呈负相关(p=0.009，R=-0.494;p=0.013，R=-0.443)。HIV组CD56bright亚群活化指标和细胞核活跃指标均高于NC组及HAART组(p＜0.001;p=0.014);而在rIL-12、rIL-15刺激下CD56bright的体外增殖能力显著低于NC组(p=0.042)。　　 2、HIV感染后CD56dim亚群数量、表型及功能变化情况　　 本研究对CD56dim亚群百分数、绝对数的研究结果显示:无论是百分数还是绝对数，HIV组CD56dim都显著低于健康对照组(p＜0.001，p=0.007)，而且CD56dim的绝对数与感染时间未见相关性，与治疗时间呈正相关(p=0.012，R=0.496)。HIV组CD56dim亚群的凋亡指标(Annexin-v)及细胞核活跃指标(ki-67)均高于NC组及HAART组(p=0.048; p=0.043);而在rII-12、rIL-15刺激下CD56dim的体外增殖能力显著低于NC组(p=0.029)。　　 3、CD56-CD16+亚群数量、表型及功能变化情况　　 本研究对CD56-CD16+亚群百分数、绝对数的研究结果显示: CD56-CD16+无论是百分数还是绝对数在HIV组都显著高于NC组及HAART组(p＜0.001，p＜0.001，p＜0.001，p=0.035)。在HIV组中， CD56-CD16+百分数与感染时间呈正相关(p=0.027，R=0.390)。在HAART组中， CD56-CD16+百分数与治疗时间有负相关趋势。对该亚群的活化、凋亡、细胞核活跃水平及增殖情况检测结果为:HIV组与健康对照及HAART组无显著性差别　　 三、CD56-CD16+亚群变化机制研究　　 1、CD57衰老标志在CD56-CD16+亚群上的表达情况　　 本研究对CD56-CD16+亚群进行表面衰老标志CD57的检测，结果显示:HIV感染者CD56-CD16+亚群表达细胞衰老标志在三群中无显著差别，推测该亚群不是从CD56dim亚群衰老后转化而来，可能仍是较为幼稚的细胞亚群。　　 2、体外直接HIV感染，未见CD56-CD16+细胞增加　　 为进一步探索CD56-CD16+亚群是否由HIV感染后CD56dim衰老转化而来，我们用HIV感染健康人PBMC，7天后检测CD56-CD16+亚群百分数，结果显示:感染后CD56-CD16+亚群百分数较对照未见有增加趋势。　　 3、CD56-CD16+体外培养向CD56dim转化　　 将CD56-CD16+亚群分选后，用rIL-12、rIL-15分别刺激6小时、24小时，检测其重新表达CD56分子情况，结果显示:随着刺激时间的延长，CD56-CD16+亚群表达CD56分子的百分数逐渐增加，提示该亚群在体刺激下可以继续向CD56dim亚群转化。　　 4、HIV感染者血清抑制CD56-CD16+向CD56dim转化　　 为了进一步研究HIV感染后增加的CD56-D16+亚群是否由于HIV感染者血浆中某些物质抑止了其继续向CD56dim分化发育导致，我们用rIL-12、rIL-15刺激分选后的CD56-CD16+亚群，并分别与健康人血浆或HIV感染者血浆共同孵育24小时，结果显示:与加入健康者血浆的CD56-CD16+细胞表达的CD56分子相比，加入HIV感染者血浆的CD56-CD16+细胞表达的CD56分子低，提示HIV感染者血浆可能有抑止CD56-CD16+继续向CD56dim亚群发育的物质存在。　　 5、CD56-CD16+与CD56dim功能比较　　 将HIV感染者CD56dim和CD56-CD16+细胞分选后，检测其分泌IFN-r情况，结果显示:与CD56dim亚群相比，HIV感染者CD56-CD16+亚群无分泌功能。　　 结论：　　 HIV感染后NK功能及亚群分布发生改变，CD56brright、CD56dim亚群减少，同时CD56-CD16+亚群增加。CD56dim功能亚群减少可能与CD56bright增殖能力降低进而导致向CD56dim分化减少和CD56dim自身复制补充不足有关。同时，CD56-CD16+亚群的分化发育成CD56dim受阻，导致了HIV感染者该亚群的增多，这是可能导致CD56dim减少的又一原因。HIV感染后CD56bright亚群和CD56dim亚群增殖能力均下降，而CD56-CD16+亚群增殖能力未见改变。HIV感染导致NK细胞增殖功能和杀伤功能均降低。HAART治疗后功能有所恢复。