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目的:明确DEHP体内代谢产物MEHP暴露对大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响;探讨PGE2在MEHP所致大鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及其机制,为预防DEHP引起的雌性生殖毒性,保护女性生殖健康提供科学依据。方法:使用DMEM-F12培养基+10%胎牛血清原代培养大鼠卵巢颗粒细胞,采用免疫荧光法对大鼠卵巢颗粒细胞进行纯度检测,CCK-8法检测细胞存活率,根据预实验结果设置实验分组与MEHP染毒剂量为:空白对照组、溶剂对照组(0.25‰DMSO)、200μM MEHP染毒组、250μM MEHP染毒组、300μM MEHP染毒组和350μM MEHP染毒组。流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot法检测凋亡相关蛋白(BAX、BCL-2、Caspase 3、Caspase 7)、PGE2受体(PTGER 2和PTGER 4)和PGE2下游基因(Gαs、cAMP、HAS2、TNFAIP6)的蛋白表达水平;Real-time PCR法检测凋亡相关基因(BAX、BCL-2)、PGE2受体基因(PTGER 2和PTGER 4)和PGE2下游基因(Gαs、cAMP、HAS2、TNFAIP6)的mRNA表达水平;ELISA法检测PGE2激素水平。明确MEHP暴露对大鼠卵巢颗粒细胞PGE2激素和细胞凋亡的影响。使用外源性PGE2在原代培养的大鼠卵巢颗粒细胞中补充PGE2激素,分析PGE2在大鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的作用及机制。实验分组为:空白对照组、350μM MEHP染毒组、10μM PGE2组和350μM MEHP+10μM PGE2组。Real-time PCR法检测凋亡相关基因(BAX、BCL-2)、PGE2受体基因(PTGER 2和PTGER 4)和PGE2下游基因(Gαs、cAMP、HAS2、TNFAIP6)的mRNA表达水平。采用IBM SPSS24.0进行统计分析。正态分布的计量资料采用±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用S-N-K检验。检验水准为α=0.05。结果:1.大鼠卵巢颗粒细胞暴露于0、16、32、64、125、250、500和1000μM MEHP 48h后,细胞存活率逐渐下降,500和1000μM剂量组细胞存活率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。MEHP对大鼠卵巢颗粒细胞的IC50为373.3μM。2.350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)。3.随着MEHP染毒剂量的增加,大鼠卵巢颗粒细胞PGE2激素表达水平逐渐下降,差异具有统计学意义(P<0.05),300μM染毒组大鼠卵巢颗粒细胞PGE-2激素分泌水平显著低于对照组及200、250μM染毒组,350μM染毒组大鼠卵巢颗粒细胞PGE-2激素分泌水平显著低于其余各组(P<0.05)。4.300μM MEHP染毒组卵巢颗粒细胞BAX/BCL-2比值显著高于对照组(P<0.05);350μM MEHP染毒组BAX mRNA表达明显高于对照组、DMSO组和200μM MEHP染毒组(P<0.05);250μM、300μM和350μM染毒组大鼠卵巢颗粒细胞BCL-2mRNA表达水平均明显低于对照组和DMSO组(P<0.05);各剂量MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞Cle-Caspase 3蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05);250μM、300μM和350μM MEHP染毒组Cle-Caspase 7蛋白表达水平均显著高于对照组、DMSO组和200μM MEHP染毒组(P<0.05)。5.300μM和350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞PTGER 4蛋白表达水平显著低于对照组和DMSO组(P<0.05)。各MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细PTGER 2 mRNA表达水平均显著低于对照组;350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细PTGER 2mRNA表达水平显著低于其余各组(P<0.05);各剂量MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞PTGER4 mRNA表达水平均低于对照组和DMSO组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。6.250、300和350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞HAS2蛋白表达水平均显著低于对照组、DMSO组和200μM MEHP染毒组(P<0.05);350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞TNFAIP6蛋白表达量显著低于对照组、DMSO组、200μM MEHP染毒组和250μM MEHP染毒组(P<0.05)。350μM MEHP染毒组Gαs mRNA表达水平明显低于对照组、DMSO组和200μM MEHP染毒组(P<0.05);250μM、300μM和350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞cAMPmRNA表达水明显低于对照组(P<0.05);各染毒剂量组卵巢颗粒细胞HAS2 mRNA表达水平均显著低于对照组和DMSO组(P<0.05);300μM和350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞TNFAIP6 mRNA表达量明显低于对照组、DMSO组和200μM MEHP染毒组(P<0.05)。7.350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞BAXmRNA表达明显高于对照组和PGE2+MEHP组(P<0.05);350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞BCL-2 mRNA表达水平显著低于对照组和PGE2+MEHP组(P<0.05);PGE2组细胞BCL-2 mRNA表达明显高于对照组(P<0.05)。8.350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞PTGER 2和PTGER 4基因mRNA表达水平均明显低于对照组(P<0.05);PGE2组大鼠卵巢颗粒细胞PTGER 2和PTGER 4基因mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05);PGE2+MEHP组大鼠卵巢颗粒细胞PTGER 2和PTGER 4基因mRNA表达水平均显著高于350μM MEHP染毒组,且PTGER 2 mRNA表达水平显著低于PGE2组(P<0.05)。9.与对照组相比,350μM MEHP染毒组大鼠卵巢颗粒细胞Gαs、cAMP、HAS2和TNFAIP6基因mRNA表达水平均显著降低(P<0.05);PGE2组大鼠卵巢颗粒细胞Gαs、cAMP、HAS2和TNFAIP6基因mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05);PGE2+MEHP组大鼠卵巢颗粒细胞Gαs、cAMP、HAS2和TNFAIP6基因mRNA表达均明显高于350μM MEHP组(P<0.05),且HAS2、Gαs基因mRNA表达明显低于PGE2组(P<0.05)。结论:1.MEHP暴露能够降低大鼠卵巢颗粒细胞存活率,促进卵巢颗粒细胞凋亡。2.MEHP暴露可影响大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关基因表达水平,可以上调Cle-Caspase 3、Cle-Caspase 7蛋白表达水平,上调BAX mRNA表达水平,下调BCL-2蛋白及BCL-2 mRNA表达水平。3.MEHP暴露可抑制大鼠卵巢颗粒细胞PGE2激素分泌,下调PGE2受体基因(PTGER 2、PTGER 4)mRNA和蛋白表达水平,同时降低PGE2下游基因Gαs、cAMP、HAS2、TNFAIP6的mRNA和蛋白表达水平。4.使用外源性PGE2增加MEHP染毒组PGE2激素水平后,PGE2受体和PGE2下游基因表达水平上升;凋亡相关基因BCL-2 mRNA表达上升,BAX mRNA表达下降。提示PGE2可以抑制MEHP引起的卵巢颗粒细胞凋亡作用。5.MEHP可能通过下调PGE2激素分泌,促使卵巢颗粒细胞凋亡;外源性PGE2可通过上调BCL-2和下调BAX,从而抑制MEHP引起的卵巢颗粒细胞凋亡。