近年来,利用生物系统获得光学纯化合物已经逐渐成为化学合成方法之外的另一选择。2-芳基丙酸类药物是一类重要的非甾体抗炎药,利用微生物中脂肪酶立体选择性的拆分,获得具有光学活性的2-芳基丙酸类药物(如酮基布洛芬和萘普生)的单一对映体己成为研究的热点。 本文以本实验室筛选出的一株具有一定不对称转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯生成(S)-酮基布洛芬能力的野生菌NK13为材料,通过提取NK13基因组DNA、Sau3AI部分酶切,回收1～6kb大小的DNA片段,与经BamHI酶切的pUC18载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,构建了该菌的基因文库。 从基因文库中筛选获得一株阳性转化子,并对该转化子质粒中的外源片段进行了测序。对测序结果进行分析表明：插入外源片段的长度为2826bp,其中包含一段完整的633bp的开放阅读框,编码由210个氨基酸残基组成的蛋白。将633bp的基因序列和其编码的蛋白序列与NCBI中已知基因序列和蛋白序列进行同源性比对,结果没有发现与基因同源的序列,与该基因编码的蛋白同源性最高的为Bacillus subtilis subsp. esterase, 同源性为85％。设计引物、PCR扩增脂肪酶目的基因,连入pET-21b(+)载体,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建了该脂肪酶的表达重组菌,SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20KDa。证明该基因是一新基因,已提交GenBank(登录号为EU381317)。 用薄层层析和高效液相色谱对表达重组菌转化酮基布洛芬氯乙酯的能力进行了鉴定,随着转化时间的延长,转化率逐渐增加,(S)-酮基布洛芬过量值(e.e.％)逐渐减少。表达重组菌4h时转化约20％消旋酮基布洛芬氯乙酯,生成(S)-酮基布洛芬e.e.％最高,达75.28％；8h的转化率达到50％；10h时的转化率约为55％,(S)-酮基布洛芬e.e.％保持在72.90％；20h时的转化率接近90％,(S)-酮基布洛芬e.e.％降低到39.46％。野生菌NK13的24h的转化率大约为40％,(S)-酮基布洛芬e.e.％最高为5.84％。说明,在未进行条件优化的情况下,表达重组菌无论是转化率还是(S)-酮基布洛芬光学纯度都比野生型NK13有了很大的提高,表达重组菌的转化时间缩短了一半以上,而生成(S)-酮基布洛芬e.e.％是野生菌的15倍。 如果能够进一步优化重组表达菌株的生长转化条件,以期找到拆分得到(S)-酮基布洛芬过量100％的最适条件,这样就有可能将工程菌用于大量生产(S)-酮基布洛芬。