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目的:构建ING4和IL-24双基因共表达腺病毒载体(Ad-ING4-IL-24),研究其对肝癌的抑瘤增效和化疗增敏效应及分子机制。方法:分别以pGEZ-Term、pAdTrack-CMV-IL-24和pAdTrack-CMV-ING4质粒为模板,PCR扩增IRES(SalI、NotI)、IL-24(XhoI、XbaI)和ING4(BglII、SalI)目的片段,依次亚克隆至pAdTrack-CMV转移载体构建pAdTrack-CMV- ING4-IRES-IL-24双基因共表达重组转移载体。将构建正确的pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24重组转移载体经PmeI酶切后与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒在BJ5183大肠杆菌中同源重组,得到的同源重组质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-IRES-IL-24(简称为pAd-ING4-IRES-IL-24)经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞,经多轮感染和扩增后获得Ad-ING4-IRES-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体。polyA+promoter介导的ING4和IL-24双基因共表达腺病毒载体(Ad-ING4-polyA+promoter-IL-24)的构建方法基本同上,唯一不同的是polyA+promoter片段的获得是:以pORF-mbcl-2a质粒为模板,PCR分别扩增polyA和promoter片段;再以此为模板,SOE-PCR扩增polyA+promoter融合片段。将Ad-ING4-IRES-IL-24(简称为Ad-ING4-IL-24)体外感染SMMC-7721、HepG2肝癌细胞及联合顺铂(CDDP)化疗药物作用,MTT法和FCM检测其体外抑制肝癌细胞生长和诱导凋亡的协同增效和化疗增敏效应,并建立SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤模型,观察Ad-ING4-IL-24体内对裸鼠人肝癌移植瘤的抑瘤增效作用。侵袭小室检测Ad-ING4-IL-24体外对SMMC-7721肝癌细胞侵袭能力的影响。Western blot和免疫组化检测细胞周期和凋亡相关蛋白及肿瘤血管形成相关因子P53、P21、P27、Cox-2、Fas、Bcl-2、Bax、Caspase-3、VEGF、CD34的表达。ELISA和半定量RT-PCR法检测Ad-ING4-IL-24对SMMC-7721肝癌细胞促血管形成因子VEGF、IL-8和肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9表达的影响。结果:成功构建了IRES和双启动子(polyA+promoter)介导的两种ING4和IL-24双基因共表达腺病毒载体(Ad-ING4-IRES-IL-24和Ad-ING4- polyA+ promoter- IL- 24)。腺病毒介导的ING4和IL-24双基因共表达(Ad-ING4-IL-24)体外能明显抑制SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的生长和诱导凋亡及抑制SMMC-7721细胞的体外侵袭能力,体内同样能明显抑制SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤的生长,且均具协同抑瘤增效作用;而且Ad-ING4-IL-24能提高CDDP化疗药物体外抑制SMMC-7721、HepG2肝癌细胞的生长和诱导凋亡的作用,具有显著的化疗增敏效应。分子机制检测结果表明:Ad-ING4-IL-24能明显上调SMMC-7721肝癌细胞P53、P21、P27、Fas、Bax、Caspase-3和下调Cox-2、Bcl-2等细胞周期和凋亡相关蛋白的表达;能明显下调肿瘤血管形成因子VEGF、IL-8、CD34的表达;还能明显下调肿瘤转移相关因子MMP-2、MMP-9的表达,且其效应均较Ad-ING4、Ad-IL-24更为显著。结论:1、国内外首次成功构建了两种ING4和IL-24双基因共表达腺病毒载体Ad-ING4-IRES-IL-24和Ad-ING4-polyA+promoter-IL-24。2、Ad-ING4-IL-24双基因表达及联合CDDP化疗药物体外抑制SMMC-7721、HepG2肝癌细胞生长和诱导凋亡呈现明显的协同抑瘤增效作用和化疗增敏效应。3、Ad-ING4-IL-24双基因表达体内抑制SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤同样具有协同抑瘤增效作用。4、Ad-ING4-IL-24双基因表达更具显著上调P53、P21、P27、Fas、Bax、Caspase-3和下调Cox-2、Bcl-2等细胞周期和凋亡相关蛋白表达的效应,这可能是其双基因表达对肝癌细胞体内外生长抑制具有协同抑瘤增效作用的重要机制之一。5、Ad-ING4-IL-24双基因表达更具显著下调肿瘤血管形成因子VEGF、IL-8、CD34表达的效应,这可能是其双基因表达对SMMC-7721裸鼠人肝癌移植瘤体内生长抑制具有协同抑瘤增效作用的另一重要机制。6、Ad-ING4-IL-24双基因表达更具显著抑制SMMC-7721肝癌细胞体外侵袭的效应,这与下调肿瘤转移相关因子MMP-2和MMP-9的表达可能密切相关。