糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)是一种在世界范围内广泛栽培的食用菌,不仅味道鲜美,而且营养价值高,深受人们的喜爱。目前,国内外对糙皮侧耳的研究主要集中在栽培育种、相关基因的克隆和表达、次级代谢产物的分离纯化及将糙皮侧耳作为生物转化的工具等,对糙皮侧耳发育相关基因功能研究则严重滞后。本实验比较了糙皮侧耳不同长度gpd启动子对其驱动效率的影响,选择了高效的795bp gpd启动子片段成功构建了适用于糙皮侧耳的超表达载体和RNAi载体,对甲硫氨酸亚砜还原酶和锰超氧化物歧化酶等发育相关基因的功能进行了系统研究。具体研究结果如下:1.糙皮侧耳发育相关基因的克隆及鉴定对菌丝体阶段表达的119个Tag进行c DNA 3′末端克隆,其中成功获得3′末端序列的Tag有83个,检出率为69.7%。将获得的基因3′末端序列提交到NCBI数据库进行比对,有41个3′末端序列与数据库中注释的基因得到较好的匹配,匹配率为49.4%。在匹配性较好的41个基因中有17个重要酶基因,由于这些酶基因对应的Tag具有较高的表达量,因此我们认为这些酶基因可能在糙皮侧耳分化发育过程中起着重要的作用,其具体功能有待下一步的验证。试验中挑选了10个基因进行5′RACE实验,获得了Msr A基因、Mn-SOD基因、Asp基因和lectin基因的5′末端序列,经拼接获得上述基因的c DNA全长。2.Asp和Mn-SOD基因在毕赤酵母中的高效表达实验克隆了Asp和Mn-SOD基因,其中Asp基因含有6个内含子,CDS序列长1212bp,编码403个氨基酸;Mn-SOD基因同样含有6个内含子,CDS序列长663bp,编码220个氨基酸。构建的表达载体电转化毕赤酵母后,经G418多拷贝转化子筛选、SDS-PAGE和Western-blot等验证表明Asp和Mn-SOD基因在毕赤酵母GS115中成功表达。重组的天冬氨酸蛋白酶和锰超氧化物歧化酶表现出生物活性。对发酵条件进行优化后,在初始p H为6.0、诱导时间为6天、每天甲醇加入量为0.7%(v/v)的条件下,锰超氧化物歧化酶粗酶活性达到最大,为156.9 U/mg。3.gpd启动子序列长度对其驱动效率具有显著影响实验以p CAMBIA1300质粒作为骨架,以不同长度gpd启动子(960bp,795bp,633bp,403bp和231bp)作为顺式驱动元件,成功构建了含有egfp和hph基因融合表达的表达载体p CAMBIA-gpdx-egfp-hph,经Southern-blot、Western-blot和荧光定量PCR实验证实在糙皮侧耳中gpd启动子长度为403bp就足以驱动egfphph基因的表达,但是gpd启动子长度为795bp时,其驱动效果最佳。4.构建了适用于超表达和RNA干涉的中间载体p GEH实验以p CAMBIA1302质粒作为骨架,成功构建了以795bp gpd启动子作为顺式驱动元件驱动egfp和hph基因融合表达的中间载体p GEH,其中egfp和hph可作为双元选择标记。中间载体p GEH中Ti质粒右边界操作方便,可被改造成超表达载体和RNA干涉载体,为后续研究其他基因的功能创造了条件。5.构建Po Msr A基因超表达载体p GEH-EM,对Po Msr A基因功能进行了研究实验中克隆了Po Msr A基因,该基因DNA序列全长908bp,含有3个内含子,CDS序列长612bp,编码203个氨基酸。利用中间载体p GEH,首次成功构建了Po Msr A超表达载体p GEH-EM,经根癌农杆菌转化糙皮侧耳菌丝体。获得的转化子对高盐、高渗、高温和高氧化性等非生物胁迫具有一定的抗性。这不仅丰富了Po Msr A基因功能研究,也为糙皮侧耳发育相关基因的利用提供了依据。6.构建了Po Mn-SOD基因超表达载体p GEH-ES和RNA干涉载体p GEH-RI,对Po Mn-SOD基因功能进行了研究实验中克隆了另外一个Po Mn-SOD基因,该基因DNA序列全长889bp,含有3个内含子,CDS长为615bp,编码204个氨基酸。利用中间载体p GEH,成功构建了Po Mn-SOD基因超表达载体p GEH-ES和三组RNA干涉载体p GEH-RI,经根癌农杆菌转化糙皮侧耳菌丝体。超表达转化子对高盐、高渗、高温和高氧化性等非生物胁迫具有一定的抗性,而干涉载体在非生物胁迫环境下生长缓慢甚至停止生长,这表明Po Mn-SOD基因对糙皮侧耳生长的重要性。利用荧光定量PCR实验证实了干涉载体p GEH-RI对Po Mn-SOD基因同系物进行了共沉默。同样利用荧光定量PCR实验,我们发现Po Mn-SOD基因3′端的干涉片段在糙皮侧耳四个生长阶段干涉效果最好。