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黑曲霉（Aspergillus niger）是曲霉属真菌中的一个常见菌种,既是重要的工业发酵菌种,同时也是导致粮食和果蔬霉变的致病性真菌。真菌病原体侵染植物体时,植物宿主细胞会启动防御机制如活性氧自由基的爆发来限制病原菌的生长,同时病原菌会激活体内的抗氧化酶类和抗氧化物质,确保自身不会受到植物免疫应答带来的损伤,抗氧化酶和抗氧化物质在菌植互作中的机制研究一直是学者关注的课题。cbsA（An05g00160）和cysA（An12g09880）是黑曲霉中分别编码胱硫醚-β-合成酶和半胱氨酸合成酶的基因,它们与生物体内重要的抗氧化物质半胱氨酸、H2S的代谢密切相关,但在抗氧化及菌植互作中所起到的作用尚不清楚。本文以黑曲霉为实验材料,利用同源重组的技术原理,构建黑曲霉cbsA和cysA敲除载体,用PEG转化黑曲霉原生质体,通过基因组PCR和qRT-PCR的方法鉴定得到突变菌株ΔcbsA和ΔcysA。以突变菌株ΔcbsA和黑曲霉A.niger MA70.15（野生型）为材料开展以下工作。首先,在正常培养条件下,cbsA缺失不影响黑曲霉的生长而在GMM（缺乏氨基酸）培养基上生长时,发现ΔcbsA生长的菌落较小,表明cbsA是氨基酸依赖性酶。通过检测黑曲霉中半胱氨酸、GSH含量,发现ΔcbsA中半胱氨酸、GSH的含量相比WT分别提高了0.28倍和0.94倍;另外利用BiGGY agar显色培养基检测硫化氢的生成,发现WT菌落比ΔcbsA菌落的颜色更深,表明cbsA的缺失降低了黑曲霉中H2S的释放量。在0.5mM CdCl2的胁迫条件下,WT的菌斑直径要明显小于ΔcbsA,培养第四天时,WT的菌落直径甚至不足ΔcbsA的一半,这表明cbsA在镉胁迫下的氧化应激反应中是一个负调节因子,然而甲萘醌、硫酸锰、氟康唑处理条件下,ΔcbsA突变体和野生型相比,没有明显差异。孢子萌发实验中,在0.5mM Cd下生长24h,对照菌株的孢子萌发率仅为45.1%,而cbsA的孢子萌发率达到71.3%,进一步表明cbsA的缺失使黑曲霉抗Cd胁迫的能力增强。将WT和ΔcbsA的孢子悬浮液接种在梨果实上,cbsA缺失导致梨果实侵染直径大于野生型,增强了黑曲霉对梨的致病性,表明cbsA是黑曲霉侵染果实的负调节因子。在WT和ΔcbsA接种的果实组织中检测了?O2–、H2O2和MDA的含量,发现与WT相比,ΔcbsA侵染梨果实后,果实组织中?O2–、H2O2和MDA的含量得到了提高,表现出更强的ROS响应,表明cbsA缺失诱导梨果实更强的应答过程。cbsA的缺失可以增加半胱氨酸Cys的含量,降低H2S的释放量,于是我们推测cbsA在黑曲霉中具有催化Cys生成H2S的功能,为验证推测,我们成功构建了黑曲霉cbsA的原核表达载体,并且在番茄中找到与cbsA同源性最高的CS、CSX1作为参考。在蛋白酶学性质实验中我们发现,cbsA、CS和CSX1都可以催化Cys生成H2S,且诱导后的cbsA催化能力提高了1.4倍。半胱氨酸合成酶是合成半胱氨酸的限速酶,其合成的半胱氨酸在抗逆方面起重要作用,但是cysA否参与黑曲霉的抗逆应答和在菌植互作中起到的功能,尚不清楚。黑曲霉有6个编码半胱氨酸合成酶的基因,所有蛋白质都含有保守的吡哆醛-磷酸依赖性酶特征的结构域PALP结构域。在GMM培养基中生长,发现ΔcysA突变体表现出较小的菌落,表明cysA也是氨基酸依赖性酶。在CdCl2、AlCl3,甲萘醌,ZnSO4,Pb（NO3）2,MnCl2,NaCl和H2O2非生物胁迫下,WT和ΔcysA的菌落直径中未发现明显差异,表明cysA可能不参与对黑曲霉在胁迫条件下的应激反应。在侵染梨和苹果的实验中,显示WT和ΔcysA之间的病变直径没有显著差异,因此得出,cysA的缺失不会影响黑曲霉对梨和苹果的侵染能力。检测WT和ΔcysA半胱氨酸合成酶的活性与半胱氨酸含量,cysA缺失对黑曲霉整体的半胱氨酸合酶活性和半胱氨酸含量没有显著影响,表明cysA不是参与半胱氨酸合成的关键基因,这可能是由于基因功能冗余造成的。定量qRT-PCR显示,和WT相比,ΔcysA突变体中编码半胱氨酸合酶的基因中An14g00960、An15g00160和An02g10750的表达水平分别提高了1.5倍、0.3倍和0.75倍。因此,我们推测其他半胱氨酸合成酶基因的上调表达可以补偿cysA的缺失,也就是说黑曲霉中可能存在对半胱氨酸合酶基因表达的负反馈调节。总结:基因cbsA的缺失导致黑曲霉内半胱氨酸含量的积累,提高了抗镉胁迫的能力和侵染梨果实的能力。原核表达的酶学性质结果显示:cbsA可以催化Cys生成H2S。cysA缺失后,不影响黑曲霉的抗氧化和侵染果实能力,qRT-PCR结果显示,黑曲霉中编码半胱氨酸合成酶的基因An14g00960、An15g00160和An02g10750表达水平上调,所以推测黑曲霉中可能存在对半胱氨酸合酶基因表达的负反馈调节。