湖南省猪星状病毒遗传变异分析与分离鉴定

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星状病毒(Astrovirus, AstV)与哺乳动物和禽类的肠道和全身性疾病有关。星状病毒最近受到越来越多的关注,因为发现它们与包括人类在内的哺乳动物的偶发性神经疾病有关。在猪中,猪星状病毒(Porcine Astrovirus, PoAstV)可以被广泛检测到,并被分为5个基因型(PoAstV1到PoAstV5),可引发猪病毒性腹泻、神经性及呼吸道等疾病,给养猪业带来一定的经济损失。星状病毒宿主范围广泛,基因变异快,具有跨种间传播并适应新宿主的能力,对公共卫生的重要性日益增加。然而,它们仍然是研究最少的肠内RNA病毒之一,主要集中在对人星状病毒的研究,且对星状病毒衣壳蛋白的分子生物学特征及病毒与宿主之间的相互作用规律的研究不多。
  在本研究中,我们从湖南省两个养猪场的43头猪身上收集到37份血清样本、20份鼻拭子和43份粪便拭子。并通过常规PCR检测到17头猪PoAstV为阳性(检出率39.5%),其中PoAstV1占16.3%(7/43),PoAstV2占18.6%(8/43),PoAstV4占9.3%(4/43),PoAstV5占14.0%(6/43)。不同样品或组织中病毒的分布不同,各样本的阳性率为:血清样本24.3%(9/37),鼻拭子20%(4/20),粪便拭子20.9%(9/43 )。获得了28条PoAstV部分RdRp序列以及PoAstV2-WG-R2/2017和PoAstV4-WG-R2/2017两个完整基因组,并用基因分析软件对获得的基因序列与数据库现有PoAstV的基因序列进行比较分析。通过基因组分析,发现目前的PoAstV2和PoAstV4与同一基因型内的其他毒株存在较大的差异。PoAstV2-WG-R2/2017基因组与其他已知PoAstV2基因组的相似度为67.2-77.4%,PoAstV4-WG-R2/2017基因组与其他已知PoAstV4基因组的相似度为72.8-80.5%。特别是同一基因型内不同株系间ORF2的Spike结构域的遗传变异较高,与其他已知的PoAstV2毒株相比,PoAstV2-WG-R2/2017的氨基酸相似度为13.7-70.9%,而与其他已知的PoAstV4毒株相比,PoAstV4-WG-R2/2017的氨基酸相似度为24.4-63.3%。此外,用RDP4重组分析软件在这两种毒株中检测到可能的重组事件。病毒衣壳蛋白氨基酸的低相似度可能导致病毒株间存在致病性的差异。
  而且,本研究进一步发现新型猪星状病毒具有广泛的组织嗜性,所获数据为PoAstVs的肠道外感染性提供了进一步的证据,而且,发现单头猪体内可共感染不同型PoAstV和可感染具有很大遗传差异的同型PoAstV。另外,在不添加胰酶的培养条件下,可用PK15细胞稳定培养增殖PoAstV5分离株。用pHUE原核表达系统成功表达出PoAstV5的衣壳蛋白Cp1和Spike,免疫Balb/C鼠获得了效果良好的多克隆抗体。间接免疫荧光实验(Immuno fluorescence Assay, IFA)表明这两个多抗识别感染细胞的中的病毒,并由此确定了PoAstV5Cp1和Spike在PK15细胞中的定位,为进一步研究PoAstV5在细胞中的复制及信号转导机制的研究提供可靠的抗体工具。
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