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背景椎间盘退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是腰痛的主要原因,给患者带来巨大痛苦,也给家庭和社会造成巨大的经济负担,而目前仍缺乏有效的治疗手段。随着细胞治疗的发展,干细胞移植成为治疗椎间盘退变的研究热门。然而,椎间盘恶劣的微环境使外源性干细胞难以存活,成了研究的瓶颈。近年来,随着髓核来源干细胞——髓核间充质干细胞(nucleus pulposus mesenchymal stem cells,NPMSCs)的发现及其更好的椎间盘微环境适应力的证实,椎间盘退变的细胞治疗开启了新的一页。然而,目前存在多种干细胞筛选方式,使得NPMSCs的分离纯化尚未得到共识。其中,控制细胞种植密度实现干细胞分离的有限稀释法,有助维持细胞活性及干性潜能,因其操作便捷,费用较低得到推广应用。既往研究报道已经利用该方法成功分离获得牙周膜干细胞、单克隆脐血间充质干细胞、齿龈间充质干细胞和髌腱干细胞。但有限稀释法是否适用于NPMSCs的体外分离,尚未见文献报道。目的本研究通过高、中、低细胞接种密度(高密度接种处理为对照组,低、中密度处理即有限稀释法为实验组)分离培养NPMSCs,从细胞形态、增殖、集落形成、迁移、细胞周期、多系诱导分化、免疫表型和干性基因表达,评估其对NPMSCs的生物学活性影响,进一步优化分离和纯化NPMSCs,为干细胞治疗DDD及组织工程种子细胞的探索打下坚实基础。方法取三月龄SD雄性大鼠髓核组织,体外培养,P1代以细胞种植密度分为三组:低密度组(5个细胞/cm2)、中密度组(100个细胞/cm2)、高密度组(10000个细胞/cm2)。各组继续培养皆以10000个细胞/cm2进行传代,观察细胞形态并检测细胞周期分布、集落形成、迁移、增殖和多系诱导分化能力,干性基因(Oct4、Sox2 和 Nanog)及干细胞免疫表型(CD29、CD34、CD44、CD45、CD90)表达情况。结果细胞外观上,各组NPMSCs均贴壁生长,局部旋涡样排列。低密度组细胞为集落样增殖,均一长梭形外观;高、中密度组细胞中出现多角形、类圆形细胞,细胞形态异质性增大,出现宽大扁平且折光性差的细胞。相比另外两组,低密度组细胞具有更强的集落形成能力、迁移能力,并且有更多的细胞进入S期,更少的细胞滞留在G0/G1期(P<0.05)。三组细胞均能够进行成骨、成脂、成软骨诱导分化,但低密度组细胞三系分化能力较其他两组增强(P<0.05)。低密度组细胞的干性相关基因Nanog、Oct4和Sox2表达量均高于其余两组(P<0.05)。低、中密度组免疫表型CD29、CD44和CD90的阳性率高于高密度组(P<0.05),而CD34、CD45在三组间无明显统计学差异(P>0.05)。结论本研究首次应用有限稀释法(5个细胞/cm2)从髓核中分离得到活性良好且干性潜能得以维持的NPMSCs,更好地应用于干细胞移植及组织工程相关研究,为椎间盘退变的研究奠定基础。