2007年英国研究小组和本实验室分别采用X染色体基因测序和候选基因定位克隆方法,发现人类CUL4B基因突变导致X连锁精神发育迟滞(X linked mental retardation, XLMR)综合征,患者除表现为精神发育迟滞外,还表现出身材矮小、步态异常、共济失调、失语、癫痫、震颤和向心性肥胖等症状。之后各国学者又陆续在多个X连锁精神发育迟滞家系检测到CUL4B基因突变,目前已经在12个X连锁精神发育迟滞综合征家系中发现了CUL4B基因突变,这使CUL4B基因成为继FMR1、ATRX基因之后,最常见的X连锁精神发育迟滞综合征致病基因。CUL4B属于cullin家族,该家族成员做为骨架蛋白参与构成CULLIN-RING连接酶复合物(CRLs)。CRLs是目前已知的最大一类E3泛素连接酶,该复合物识别并降解特异性的底物,参与调控许多重要的生命活动,如细胞周期、基因转录、细胞信号传导和生物体发育等。目前研究发现cullin蛋白家族包括8个成员：CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、 CUL7和PARC,其中CUL4A和CUL4B同源性最高,蛋白同源性高达83%,在低等生物中仅存在Cul4一种同源蛋白。人类CUL4B基因突变导致精神发育迟滞综合征,Cul4a基因敲除小鼠仅表现出精子发育异常,这说明在个体发育尤其是脑发育过程中CUL4A不能代偿CUL4B的功能。目前发现的CRL4B的特异性的底物有：ERα、cyclin E、TopoI、PrxⅢ、 WDR5、TSC2、Jab1/CSN5、β-catenin等,这些底物在细胞周期、细胞分化、肿瘤发生以及转录调控等发面发挥着重要作用。为研究CUL4B在精神发育迟滞综合征发生中的作用机制,本研究在分析小鼠Cul4b基因表达的基础上,采用条件性基因敲除方法建立Cul4b基因敲除小鼠模型,并对其进行了表型分析。本课题主要分为以下四部分：第一部分小鼠Cul4b表达模式分析做为分析小鼠Cul4b功能的第一步,我们首先以野生型C57BL/6J小鼠为研究对象,分析了Cul4b在小鼠多种组织尤其是脑组织中的时空表达特点、亚细胞定位以及表达的神经细胞类型。1)采用Western blot和免疫组织化学的方法分析了Cul4b在小鼠胚胎期及成年期多种组织器官中的表达水平。Western blot结果显示在胚胎期和成年期小鼠脑、脊髓、心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织器官中都有Cul4b的表达。其中在胚胎期和成年期的脑组织中,Cul4b一直高表达。Cul4b在心脏中表达水平较低,成年期表达量很少,几乎没有。免疫组织化学的结果与Western blot的结果一致。高倍镜下我们发现,Cul4b在脑、心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织器官中主要亚细胞定位于细胞核。2)利用Western blot和免疫组织化学的方法分析了不同发育时期(E14.5、E17.5、P0、P14、P60等)小鼠脑组织中Cul4b的时空表达情况,重点分析了与学习记忆密切相关的皮层和海马。结果发现,在胚胎期到成年期的小鼠大脑中,Cul4b一直高表达,特别是在皮层和海马表达量非常高。与以往研究认为Cul4b在增殖细胞中高表达的研究结果不同,Cul4b在室管膜下区活跃增殖的神经干细胞和神经前体细胞中表达水平很低,而主要在分裂后的成熟神经细胞中表达。这一结果提示Cul4b在神经系统中可能发挥着不同于在其他组织、细胞中的独特作用。3)利用Cul4b与成熟神经元标志物NeuN进行免疫荧光双染,结果发现Cul4b与绝大部分NeuN共定位,提示Cul4b主要在神经元中表达。第二部分Cul4b条件性基因敲除小鼠模型的建立实验室前期研究发现,携带CUL4B突变基因的细胞具有选择劣势,因此我们推测,很难通过经典的基因敲除策略得到Cul4b缺陷的ES细胞。为此,本研究采用条件性基因敲除策略,先建立Cul4b基因打靶小鼠即Cul4b floxed小鼠。在得到Cul4b floxed小鼠后,通过与不同类型Cre转基因小鼠交配后,获得Cul4b条件性基因敲除小鼠。首先我们构建了基因打靶载体,在Cul4b基因3-5外显子的上、下游各引入一个loxP位点,同时为便于筛选还在内含子5中插入了neo基因,载体上插入了TK基因。构建好的载体经线性化后电转入129小鼠雄性ES细胞,经过筛选后,利用Southern blot和长片段PCR方法对96个ES细胞克隆进行了分析,从中获得了两个正确重组的ES克隆。将这两个正确重组的ES细胞注射入 C57BL/6J小鼠囊胚后获得嵌合型小鼠,嵌合型小鼠与野生型小鼠交配后获得Cul4b基因打靶小鼠,即Cul4b floxed小鼠。为验证以上方法可以获得Cul4b敲除小鼠,我们首先将Cul4b floxed、鼠与Nestin-Cre转基因小鼠交配,得到Cul4b神经系统特异性敲除小鼠。进而从敲除小鼠大脑提取蛋白和RNA进行分析。神经组织特异性敲除小鼠脑组织Cul4b基因cDNA测序分析证实缺失外显子3-5后,外显子2和外显子6相接,导致移码突变,突变基因即使翻译也只能产生28个氨基酸组成的短肽；实时定量PCR分析发现缺失外显子3-5的Cul4b mRNA表现为无义突变介导的mRNA降解；Western blot结果证实在敲除小鼠的脑组织中几乎检测不到Cul4b蛋白。以上分析证实采用以上策略可以获得Cul4b基因缺失小鼠。第三部分Cul4b全身性敲除小鼠的表型分析为研究Cul4b在发育中的作用,我们首先建立了Cul4b全身性敲除小鼠模型。1)将Cul4b floxed小鼠与ElIα-Cre转基因小鼠交配可以建立Cul4b基因全身性敲除小鼠模型,但在新生小鼠中未检测到敲除小鼠,提示敲除小鼠胚胎期致死。2)为明确Cul4b敲除小鼠胚胎致死时间,通过定时交配获得了准确孕龄的各发育阶段小鼠,发现在E7.5和E8.5可以获得敲除小鼠,但在E9.5不能检测到敲除小鼠,说明Cul4b基因敲除小鼠胚胎在8.5至9.5天之间死亡。H&E染色发现Cul4b敲除小鼠E7.5天胚胎明显小于野生对照,而且胚胎组织结构紊乱。3)为明确Cul4b敲除小鼠胚胎致死原因,我们对小鼠胚胎细胞增殖和凋亡情况进行了分析,发现Cul4b敲除小鼠胚胎细胞增殖明显减少,而细胞凋亡则明显增加；同时我们也发现Cul4b敲除导致cyclin E的累积,与体外研究结果一致。4) Cul4b基因敲除杂合子小鼠出生数量也明显低于预期,且新生的杂合子小鼠相对于同窝对照小鼠发育明显迟滞。但是随着出生后发育,Cul4b基因杂合子小鼠的发育水平能逐渐赶上对照小鼠。进一步分析发现,杂合子小鼠的胎盘发育异常可能是导致杂合子小鼠子宫内发育迟缓的原因。第四部分Cul4b神经系统特异性敲除小鼠的表型分析由于Cul4b基因全身性敲除小鼠胚胎期致死,无法获得基因敲除小鼠用于神经发育分析。为此,我们将Cul4b floxed小鼠与Nestin-Cre转基因小鼠交配,得到Cul4b神经系统特异性敲除小鼠。1)神经系统特异性敲除小鼠的敲除效率已在第二部分研究中经大脑组织cDNA测序、实时定量PCR和Western blot等方法得到验证。我们利用免疫荧光染色方法分析了培养的小鼠皮层原代神经元,未检测到Cul4b表达,进一步验证了利用上述交配策略可以得到Cul4b神经系统特异性敲除小鼠,即Cul4bNestin-Cre小鼠。2)我们对Cul4b神经系统特异性敲除小鼠进行了长期观察(>2年),并未发现敲除小鼠存在明显发育异常。利用Morris水迷宫,旷场试验以及高架十字迷宫分析了Cul4b神经系统特异性敲除小鼠的行为学变化。结果发现,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠学习和记忆能力下降。这与人类CUL4B基因突变导致智力低下表型一致。Cul4b神经系统特异性敲除小鼠是研究精神发育迟滞的良好模型。3)利用H&E染色分析了不同发育时期(E17.5, PO, P14, P60) Cul4b神经系统特异性敲除小鼠和同窝对照小鼠的脑组织切片,结果发现Cul4b神经系统特异性敲除小鼠脑组织结构上无明显异常。4)Ki67免疫组织荧光显示Cul4b神经系统特异性敲除小鼠细胞增殖无明显异常,TUNEL结果显示,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠细胞凋亡也无明显变化,Birthdating实验结果显示,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠神经细胞迁移与正常对照无明显差异。5)因为Cul4b主要表达于分裂后的成熟神经元,我们对新生小鼠和成年小鼠的脑切片进行了神经元标志物NeuN的免疫组化检测,结果发现Cul4b神经系统特异性敲除小鼠NeuN的表达与对照小鼠相比无明显差异。6)对培养的E17.5皮层原代神经元细胞进行免疫荧光结果发现,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠Map2(神经元树突标志物)和Tau(神经元轴突标志物)表达情况与对照小鼠无明显改变,提示在脑中敲除Cul4b并不影响树突和轴突的大体结构。7)利用Western blot分析了已报道的CRL4B复合物底物蛋白cyclin E, WDR5,和(3-catenin等在敲除小鼠中的表达情况,未检测到异常表达。综上所述,我们发现Cul4b在小鼠胚胎期和成年期的多种组织中广泛表达,亚细胞定位于细胞核,其中在脑中表达最高,而且主要在分裂后成熟神经元中表达。利用条件性敲除策略,我们成功获得了Cul4b全身性敲除小鼠和神经系统特异性敲除小鼠。Cul4b全身性敲除小鼠胚胎发育至8.5天左右死亡,对E7.5天胚胎分析发现,Cul4b敲除小鼠胚胎细胞增殖明显降低、而细胞凋亡明显增加,同时有cyclin E的累积。Cul4b基因敲除杂合子小鼠出现子宫内发育迟缓,其原因可能是胎盘发育异常所致。Cul4b基因神经系统特异性敲除小鼠发育大体正常,组织学分析也未发现明显异常,但行为学分析发现,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠的学习和记忆能力下降,与人类CUL4B基因突变导致智力低下的临床表型一致。因此,Cul4b神经系统特异性敲除小鼠是研究精神发育迟滞的良好模型,有助于研究精神发育迟滞发生的分子机制和发现治疗靶点。