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为探讨睾丸注射法制备转基因猪的高效性,本试验应用PCR检测、Southern印迹杂交、荧光定量PCR分析等技术,检测通过睾丸注射法制备的第一代转pGH基因猪阳性率。利用FISH杂交技术研究外源基因在染色体上的具体整合情况,对比外源基因在不同个体基因组中的整合位点与数目,为转基因动物的定向培育及研究杂交数目与日增重相互关系提供依据。
1.转基因猪阳性率的鉴定
为分析睾丸注射法制备的第一代转pGH基因猪阳性率,本试验采用PCR检测、Southern印迹杂交、荧光定量PCR三种方法对其进行阳性鉴定。结果表明:通过PCR扩增及测序的56头仔猪中39头为阳性,死淘8头中4头为阳性,则有效阳性率为72.92%(35/48);通过对PCR测序后的阳性个体再进行Southern杂交,阳性率为54.17%;采用PCR定量分析法对16头阳性个体与16头同龄非转基因猪进行试验,发现转基因与非转基因猪达到阈值所需循环数分别为27.5206、27.7039,其中转基因猪mRNA表达量是非转基因猪的1.17倍,表明外源DNA已整合于猪染色体上并能在子代稳定遗传,但不同个体外源基因在体内的拷贝数及表达水平具有差异性。
2.pGH外源基因在染色体上定位研究
为进一步探索通过睾丸注射法制备的F0代转基因猪外源基因在染色体上的整合位点与数目以及对增重的影响,本试验采用FISH杂交技术分析6头转基因猪与2头非转基因猪。结果表明:转基因猪之间及其染色体上杂交信号位置与数目均不同,杂交信号主要分布在1、6、8、13号染色体上;非转基因猪染色体上无杂交信号;总体上转基因猪染色体上杂交信号数越多,其从出生到育肥期的平均日增重值越大。