血吸虫病是一种亟待解决的严重危害公众健康的公共卫生问题，目前的主要防治方法是以人群吡喹酮化疗为中心，结合易感地带灭螺的综合性措施。近年来，随着分子生物学等技术的发展，作为血吸虫病综合防治的一项潜在性措施—血吸虫病疫苗应用的研究，已成为血吸虫病防治研究的热点之一。迄今，若干国内外实验室内已克隆和表达了一系列日本血吸虫抗原基因，获得了数种疫苗候选分子，但由于血吸虫本身抗原成分比较复杂，一种疫苗候选分子仅能诱导部分保护力，人们由此设想，要达到理想的抗血吸虫感染的目的，有必要将尽可能多的疫苗侯选分子适当地结合在一起，组成多价复合疫苗。因此，继续寻找新的有价值的疫苗候选分子，显得非常重要。 本研究主要内容概括如下：一、日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白分子及其抗原表位的克隆和免疫保护作用的研究 本室已从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选到一基因片段（Sj338/24），初步认为可能是编码日本血吸虫线粒体D 南京医科大学博士学位论文DD 相关蛋白基因。已知线粒体与血吸虫的能量代谢及代谢调节DD 密切相关，本研究在此基础上，对该基困进行较系统深入的DD 研究，试图从干扰虫体的能量代谢及代谢调节方面寻找新的DD 疫苗侯选分子，探索日本血吸虫病疫苗研究的新途径。DDI．日本血吸虫线粒体相关蛋白的基困克隆及特性鉴定D 用DNASIS软件分析该基困片段旧p38o4)的开读框，D 在起始密码上游及终止密码的下游分别设计引物A和B，DD 并在两个引物的5’端分别设计了一个ECORI和NOtl酶切位D 点。以原基因片段Sp38侣4为摸板，进行PCR，再以 1o琼l 脂糖凝胶电泳分离 PCR产物并切下目的条带，纯化获得目 l 的 DNA片段 Sj 3 3 8。将目的片段亚克隆入 pGEM－T载体， 并转化到大肠杆菌 JM 09中，用 X唱al／Amp选择培养基挑D 选阳性克隆，碱裂解法提取质粒进行鉴定，并选阳性克隆菌Dl 株进行目的基因片段的核菩酸序列测定，再用 DNASIS软 lD 件和 BLAST数据库对目的 DNA测序资料进行分析；并分 DD 析其与已发表的基因序列的同源性。结果显示：a338基因D 片段长487hp 含一个由459hp组成的开放阅读框，编码一l 由 15 3个氨基酸残基组成的多肽，分子量为 17．6kDa。氨基 ll 酸同源性分析发现；重组蛋白与人的线粒体传入受体亚单位ll 氨基酸同源性为46％，与褐鼠线粒体膜受体前体的氨基酸ll 同源性为 44％。l 将阳性克隆pGEM1／Sj338进行培养，提取质粒，进行D EC。RI和 N川 双酶切，纯化获得目的基因片段 Sz338，与经 D 双酶切的表达载体pGEx6pl连接，构建重组质粒pGEX－ 6p刁侣p 3 8，并转化入大肠杆菌BLZI后，筛选阳性菌落并D 提取重组质粒，进行双酶切鉴定；并将巳经鉴定的阳性菌落121D 南京医科大学博士学位论文l 接种于 YT培养基中进行培养，用 IPTG i％导表达；离心集D 菌进行SDS－PAGE凝胶电泳鉴定，并用日本血吸虫成虫抗I 原免疫兔血清和重感染兔血清对表达蛋白进行Western七lot 免疫识别，其结果显示：成功地构建了 pGEX乃p／Sj 3 3 8重D 组体。由于该载体含有一个日本血吸虫谷耽甘肽转移酶l（GST）基因，并可与重组基因高效融合表达，表达产物为IGST 与重组蛋白的融合蛋白。对表达产物的 SDS．PAGE及OWestern七lot分析结果显示：阳性表达克隆所产生的融合蛋D 白能够被重感染兔血清及成虫免疫兔血清所识别，初步说明D 重组蛋白具有与天然蛋白相同的抗原表位。12．融合蛋白的纯化、组织化学定位及动物免疫保护性实验 将表达菌株pGEX－6p上／Sj338／BL21接种于YT培养基，IIPTG诱导表达，离心收集菌体。菌体经冻融、超声破菌及 lD 提取包涵体后；用分子筛柱层析纯化融合蛋白并使之复性，l 再用Western七＊ 方法对纯化蛋白的抗原性进行分析，结果 显示：经分子筛纯化后的融合蛋白经 SDS－PAGE 电泳鉴定 l 达电泳纯，Western blot显示，纯化蛋白能够被日本血吸虫 亩威染兔血清及日本血吸虫成虫免疫兔血清识别，说明纯化D 后的融合蛋白具有较高的纯度和较强的免疫活性。D 为了对重组蛋白rsi338进行组织化学定位；将活的日 本血吸虫成虫经固定、包埋，制成超薄切片，置于镍网上。 将融合蛋白免疫的兔血清经过纯化获得?