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本研究以纯化的原核表达融合蛋白rHIS-BovIFN-γ免疫BALB/c小鼠,以原核表达融合蛋白rGST-BovIFN-γ为筛选抗原,通过淋巴细胞杂交瘤技术,研制出6株稳定分泌抗牛IFN-γ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C12、4A10、5F5、6E12、2D10、6F6,经初步鉴定,6株单抗均能特异性识别并结合rBovIFN-γ,且不与鸡-γ干扰素、白介素-2发生交叉反应;免疫球蛋白亚类依次为IgG1、IgM、IgM、IgM、IgG2a、IgM,杂交瘤上清间接ELISA效价为1:1600、1:400、1:3200、1:800、1:800、1:1600,腹水效价为1:12800、1:3200、1:25600、1:12800、1:6400、1:12800。应用A蛋白亲和层析对免疫球蛋白为IgG的1C12、2D10进行纯化,并用辣根过氧化酶(HRP)标记。纯化后的1C12、2D10达到了电泳纯,纯化抗体效价为1:6400、1:6400,酶标记物HRP-1C12、HRP-2D10质量鉴定为:克分子比(E/P)分别为1.01和1.06;标记率分别为0.378和0.368,达到了预期的结果。通过对6株单抗初步应用筛选,采用以5F5与6F6两株单抗按1:1体积比,浓度为13μg/ml作为包被抗体,酶标抗体HRP-1C12稀释比例1:800,浓度为5μg/ml作为第二抗体,建立抗体夹心ELISA方法,并摸索封闭液、稀释液、抗原最佳反应时间、酶标抗体反应时间、底物最佳反应时间及结果判定标准等条件,最终选择含10%小牛血清的磷酸盐缓冲液作为封闭液,含0.5%BSA、0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液作为稀释液,抗原反应时间为75min,酶标抗体最适反应时间为60min,底物最佳反应时间为10min,结果OD492检测值大于或等于0.185,样品判为阳性,OD492值小于0.155,则判为阴性,两者之间判为可疑。此方法敏感性达到可检出0.5μg/ml重组牛γ-干扰素(rIFN-γ),并与鸡γ-干扰素(rCHIFN-γ)、白介素-2(rCHIL-2)不发生交叉反应。采用牛结核菌素皮内试验(TST)、牛γ-干扰素EIA及抗体夹心ELISA方法等3种方法对182份奶牛进行检测,结果表明,牛γ-干扰素EIA与TST相比:敏感性为30.30%,特异性为82.05%,符合率为39.56%;抗体夹心ELISA与TST相比:敏感性为39.69%,特异性为70.27%,符合率为48.35%;抗体夹心ELISA与牛γ-干扰素EIA相比:敏感性为78.18%,特异性为82.3%,符合率为74.72%。牛γ-干扰素EIA以及抗体夹心ELISA与TST符合率较低,抗体夹心ELISA与牛γ-干扰素EIA符合率较高,为三种方法在国内的检测比较提供了一定的数据。实验成功制备了6株鼠抗牛rIFN-γ单克隆抗体,建立了抗体夹心ELISA方法,并进行初步应用,为牛结核病快速检测提供了可能,为后期的推广应用奠定了基础。