子宫颈癌是全球女性中发病率仅次于乳腺癌的恶性肿瘤，其发病率呈升高和低龄化的趋势。现有的研究表明，人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是导致子宫颈癌发生的主要原因。尽管目前针对HPV6，11，16，18型的宫颈癌预防性疫苗研究取得突破性进展，并使得宫颈癌的一级预防成为可能，但对于现存宫颈癌患者的治疗，目前仍有很多问题需要解决。造成子宫颈癌治疗困难的主要原因之一即为肿瘤转移(metastasis)。肿瘤转移是一个多因素、多步骤参与的复杂的生物学过程。细胞迁移(cell migration)为肿瘤组织转移的首要步骤，而细胞肌动蛋白骨架(actin)的重构(reorganization)是细胞迁移的第一步：肌动蛋白在质膜皮质层下聚集，伸出伪足(pseudopodia)和突起(protrusion)，与细胞外基质黏附；随之细胞借助肌动—肌球蛋白收缩装置，产生迁移所需的动力，细胞进而移位(translocation)，胞体回缩(retraction)，解除黏附。通过这一循环往复的生物学过程，细胞完成其动态的迁移过程。细胞肌动蛋白骨架重构受埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族调控。Moesin蛋白为该家族的成员之一，集中于富含肌动蛋白的细胞表面结构，如微绒毛、板状伪足等处。在未被激活状态下，其N端FERM区与C端交互作用，自行封闭其与胞膜、肌动蛋白的结合位点。细胞外信号刺激因子可通过改变分子构象而激活moesln蛋白，后者作为桥梁分子介导actin与质膜的交联，引发肌动蛋白骨架的重构，从而调控细胞生长、迁移。近年来的研究表明，ERM蛋白参与多种妇科肿瘤发展、浸润和转移的过程。我们的前期工作也表明，moesin蛋白高表达或磷酸化与宫颈癌恶性程度呈正相关，提示moesin蛋白在宫颈癌的转移过程中起到重要作用。 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族成员对宫颈癌的生长及转移具有重要影响。VEGF—C是VEGF家族的成员之一，其促进肿瘤生长、侵袭和转移的作用已引起研究者的重视。大量的研究证实，产生VEGF—C的肿瘤细胞具有更高的侵袭和转移能力。VEGF—C促宫颈癌转移的机理尚未完全阐明。目前的研究认为，VEGF—C与其受体的结合，可激活丝裂酶原活化蛋白激酶(MPAK)和蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，刺激血管内皮细胞和淋巴内皮的增生和迁移。新生淋巴管和血管在肿瘤生长转移中，为肿瘤组织提供营养物质，从而加速肿瘤的转移过程。值得注意的是，在这些机制之外，VEGF—C也可直接作用于肿瘤细胞本身，促进肿瘤细胞的运动和迁移能力。如有研究报道，在培养的卡波济氏肉瘤细胞株上，可以观察到VEGF—C促进肿瘤细胞的迁移，说明在促进新生淋巴和血管形成的作用之外，VEGF—C可促进肿瘤细胞本身的侵袭和迁移能力。我们的前期工作也证实：VEGF—C可通过促进moesin蛋白表达和磷酸化，引发宫颈癌细胞内的肌动蛋白骨架重构，导致宫颈癌细胞板状和丝状伪足增加，促进宫颈癌细胞株的迁移和侵袭能力。但是，VEGF—C通过何种细胞内信号转导机制促进moesin蛋白的表达和磷酸化，尚有待进一步证实。 近来的研究表明，RhoA/ROCK/moesin为一条重要的细胞内信号转导通路，参与调节肌动蛋白细胞骨架重构。在培养的人脐静脉内皮细胞及T47D乳腺癌细胞上，该通路均可介导moesin蛋白的激活，进而促进细胞的迁移。RhoA为小G蛋白Rho GTP酶家族，这些单体GTP酶与G蛋白一样，类似分子按钮在GTP结合(活化状态)与GDP结合状态(失活状态)之间转换，触发下游激酶级联反应而发挥生物学效应。ROCK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是目前功能研究最为清楚的Rho下游靶效应分子。而最新的文献报道显示，VEGF可通过激活RhoA/ROCK信号通路，介导VEGF促进血管内皮细胞的迁移的作用。上述的研究背景提示，在宫颈癌的发生发展中，VEGF—C也有可能通过激活RhoA/ROCK信号通路，进而调控moesin蛋白的表达和磷酸化，从而引发肌动蛋白细胞骨架的重构，提高肿瘤组织细胞的迁移和侵袭能力。 基于VEGF—C及moesin蛋白在多种肿瘤组织转移中的作用，本研究在前期工作的基础之上，在组织和细胞水平观察VEGF—C对RhoA/ROCK信号的激活作用，并利用ROCK信号的阻断剂作为工具药物，探索该信号通路对moesin蛋白表达和磷酸化的影响，从而明确VEGF—C调控moesin蛋白的内在分子机制。本研究有利于揭示子宫颈癌转移的内在分子机理，为临床上开发出针对宫颈癌患者的全新有效的治疗药物提供重要的实验依据和思路，从而提高宫颈癌患者的治愈率和生存率。 研究目的： 本课题利用临床上活体取材的不同病理分期的宫颈癌组织标本，采用分子生物学方法，测定不同分期的肿瘤组织中RhoA/ROCK—2信号通路的蛋白表达量变化。在培养的宫颈鳞癌细胞株Siha细胞上，重点从信号转导方面探讨VEGF—C通过激活RhoA/ROCK信号通路，调控moesin蛋白的表达和磷酸化，并引发肌动蛋白骨架重构及促进宫颈癌转移的作用。 研究方法： 1.选取2006年6月1日～2008年8月1日期间中山大学附属第一医院首次诊治的共33例标本，其中12例原位癌(CIN)，11例鳞癌Ⅰ期，10例鳞癌Ⅱ期(未行放化疗)作为研究对象。同时取同期因子宫肌瘤行子宫切除的正常宫颈组织10例作为对照。每份标本均取材两份，一份行病理诊断，一份依据临床分期分组作为实验对象。 2.提取正常及上述不同分期的宫颈癌组织蛋白。蛋白定量后利用Western blot技术测定RhoA/ROCK—2的蛋白含量变化。实验分组：①正常对照组；②CIN组；③鳞癌Ⅰ期组；④鳞癌Ⅱ期组(未行放化疗)。 3.在培养的宫颈癌细胞株Siha细胞上，观察RhoA/ROCK—2信号转导通路在VEGF—C促moesin蛋白表达、蛋白磷酸化的作用。实验分组：①对照组；②VEGF—C处理组；③VEGF—C+ROCK—2特异性抑制剂Y27632组；④VEGF—C+ROCK—2siRNA组。 4.在培养的宫颈癌细胞株Siha细胞上，观察VEGF—C对RhoA/ROCK—2的激活作用。实验分组：①对照组；②VEGF—C处理组；③VEGF—C+VEGF—C单克隆抗体组； 5.在培养的宫颈癌细胞株Siha细胞上，观察RhoA/ROCK—2在VEGF—C诱导的细胞迁移中的作用。实验分组：①对照组；②VEGF—C处理组；③VEGF—C+VEGF—C单克隆抗体组；④VEGF—C+ROCK—2特异性抑制剂Y27632组；⑤VEGF—C+ROCK—2 siRNA组。 6.统计方法：定量结果均用均数±标准差表示。以SPSS软件9.0进行单因素方差分析(One Way ANOVA)以检验各组之间差异，P<0.05被认为有统计学意义。 研究结果： 1.正常组织及宫颈癌组织中RhoA/ROCK—2蛋白的表达：与正常宫颈组织比较，CIN组织中RhoA/ROCK—2蛋白表达分别增加了(52±8)％、(64±9)％(n=4，P<0.05)，鳞癌Ⅰ期RhoA/ROCK—2蛋白表达进一步增高(102±16)％、(89±11)％(n=4，P<0.01)，鳞癌Ⅱ期RhoA/ROCK—2蛋白表达增高更为显著，其幅度为(186±24)％、(147±21)％(n=4，P<0.001)。 2.在培养的宫颈癌细胞株Siha细胞上，VEGF—C作用24 h后，可明显增加moesin蛋白的表达和磷酸化，moesin蛋白、P—moesin表达分别增加了(84±11)％、(106±18)％(n=3，P<0.01)。ROCK—2特异性抑制剂Y23672、ROCK—2抑制性小RNA(siRNA)可抑制VEGF—C对moesin及P—moesin蛋白表达的上调作用(n=3，P<0.01)。 3.VEGF—C作用于培养的宫颈癌细胞株Siha细胞24 h后，可明显促进RhoA/ROCK—蛋白表达，其增加幅度为(127±24)％、(86±10)％(n=3，P<0.01)。同时，VEGF—C可促进RhoA/ROCK蛋白活性，其增加幅度分别为(144±28)％、(156±23)％(n=3，P<0.01)。VEGF—C单克隆抗体可明显阻断VEGF—C促RhoA/ROCK蛋白表达和活性的效应(n=3，P<0.05)。 4.VEGF—C作用于培养的宫颈癌细胞株Siha细胞24 h后，可明显促进细胞迁移。与对照组比较，其迁移数目增加(122±28)％(n=6，P<0.01)。ROCK—2特异性抑制剂Y23672预处理细胞后，可明显抑制VEGF—C促细胞迁移的作用，抑制幅度为(64±9)％(n=6，P<0.01)，转染ROCK—2特异性siRNA后，VEGF—C促细胞迁移的作用受到明显抑制，抑制率为(69±10)％(n=6，P<0.01)。 结论： 1.随着宫颈癌恶性程度的增加，宫颈癌组织中RhoA/ROCK—2蛋白含量均增加，提示该信号通路在宫颈癌的恶变中发挥重要中介作用。2.VEGF—C可通过其受体激活RhoA/ROCK—2信号通路，进而上调moesin蛋白含量表达和磷酸化，从而促进宫颈癌细胞的转移。