研究背景肥胖(obesity)是一种能量失衡所导致的慢性代谢性疾病,其常伴发2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心脑血管疾病、睡眠呼吸暂停综合征等疾病,并与数种肿瘤的发生有密切的关系,同时还与全因死亡率的增加具有一定程度的相关性,近年来肥胖的全球发病率逐年升高,已然成为全球公共卫生面临的巨大挑战。白色脂肪组织作为机体一种主要的能量储存器官,在营养性肥胖的发生发展过程中起着重要作用。在脂肪细胞分化以及进行脂肪储存及脂肪动员过程中,线粒体作为一种调节能量代谢的细胞器发挥着重要作用,故维持其稳态平衡状态十分重要。然而由于其功能的特殊性,线粒体在肥胖发生过程中极易受到氧化应激的损伤。目前已有文献报道,能量过剩所致的代谢应激使白色脂肪组织中线粒体产生过多的活性氧簇,并无法及时清除,反过来会造成线粒体的损伤,影响脂肪细胞的功能,从而加重肥胖。另有文献介绍,损伤的线粒体经过细胞内一定的修复机制,有些可与其他线粒体融合生成新的功能完整的线粒体,而另有一些无法被修复的线粒体则会通过PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)-Parkin 通路介导的线粒体自噬,被细胞溶酶体分解再利用。线粒体自噬可以维持细胞内具有一定数量的较高的质量的线粒体,从而保障了细胞的整体功能。PINK1是一种核编码的线粒体蛋向,当线粒体功能正常时,PINK1分子会被线粒体内膜蛋白剪切酶PARL(presenilins-associated rhomboid-like protein)分解失活,而当线粒体功能受损无法修复并导致其膜电位下降时,胞浆中的PINK1分子会聚集到受损线粒体的表面,并招募其下游分子Parkin以及一些自噬相关分子。Parkin是一种E3泛素连接酶,在接受PINK1激活信号后,可从胞浆逐渐转移到线粒体膜表面,然后招募微管相关蛋白1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白家族,逐渐形成线粒体自噬小体,并被溶酶体所降解,从而使受损的线粒体被清除。总体而言,PINK1/Parkin可以通过线粒体自噬来保障细胞内线粒体整体功能水平,对细胞具有一定的保护作用,但是在能量过剩引起代谢应激的前提下,PINK1/Parkin信号通路是否参与保护脂肪细胞的功能尚未可知。因此研究PINK1/Parkin信号通路对于明确脂肪细胞在能量过剩的条件下维持其基本功能的机理十分重要,或为肥胖的治疗提供一种新的思路。研究目的A.明确PINK1/Parkin在高脂饮食诱导的肥胖小鼠脂肪组织中的表达情况。B.明确PINK1/Parkin对棕榈酸处理的3T3-L1细胞线粒体功能的影响。C.明确PINK1/Parkin对棕榈酸处理的3T3-L1细胞凋亡的影响。研究方法(一)动物处理1.本研究选用4周龄的雄性C57BL/6J小鼠。在适应饲养环境后,45只小鼠随机分为普通饮食对照组(CTRL)15只和高脂饮食组(HFD)30只,分别喂养12周,每周测量并记录体重。2.分别在第11周和12周进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT),腹腔胰岛素耐量试验(IPITT)。3.在喂养即将结束时,用双能X线检测小鼠体脂含量,验证造模成功。之后,麻醉小鼠,心尖取血测血脂等生化指标,取小鼠腹部皮下脂肪、附睾旁内脏脂肪。4.通过透射电子显微镜观察脂肪组织中线粒体形态结构。5.通过qPCR、Western blot检测PINK1/Pakin等相关蛋白的表达情况。(二)细胞培养1.用含有10%的胎牛血清(FBS)的DMEM高糖培养基培养3T3-L1细胞。2.用 Lipofectamine2000 转染 PINK1/Parkin 的小干扰 RNA。3.用不同浓度的棕榈酸溶液刺激细胞48h,之后用qPCR、Western blot检测不同条件处理的细胞各种目的基因、蛋白的表达情况。4.细胞凋亡检测:使用TUNEL凋亡检测试剂盒检测不同处理条件下细胞凋亡的情况。5.细胞免疫荧光染色:将不同刺激条件处理后的细胞接种在细胞爬片上面,固定后,一抗二抗孵育,封片,镜下观察。6.线粒体功能的检测:将不同刺激条件处理后的细胞用ROS检测试剂盒、ATP检测试剂盒、JC-1检测试剂盒进行检测。研究结果1.PINK1/Parkin信号通路在肥胖小鼠脂肪组织中被激活。2.PINK1/Parkin信号通路阻止了 PA诱导的3T3-L1细胞线粒体功能下降。3.PINK1/Parkin信号通路阻止了 PA诱导的3T3-L1细胞凋亡。研究结论PINK1/Parkin信号通路通过维持细胞内线粒体的功能,在一定程度上保护了细胞免受代谢应激的损伤。