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微生物分类鉴定技术在临床、CDC、食品、药品、出入境检验检疫等领域广泛应用。其中,临床微生物鉴定检验在感染性疾病诊断、用药指导、医院感染控制、抗菌药物管理等多方面均扮演着重要角色;肉类、蔬菜等食品中的大肠杆菌O157:H7,肠炎沙门氏菌等导致食品中毒的食源性致病菌的检测鉴定已经成为食品卫生行业不可或缺的关键环节;同样,微生物准确、快速鉴定,在CDC病原菌溯源监测,药品微生物污染检验与监管,进出口食品、药品、化妆品等致病菌检测中不可或缺。目前,常用的微生物鉴定方法主要有基于传统表型学的形态观察、生化鉴定方法和基于分子遗传学的基因鉴定,如16S rRNA,PCR方法等。但以上方法存在着各自的弊病,导致样本流转时间长、操作复杂、鉴定准确率低、成本高等问题。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是一种软电离飞行时间质谱,通过MALDI-TOF MS获取、识别微生物肽质量指纹图谱（PMF）进行快速、准确、高通量鉴定,是微生物鉴定的革命。出于以上优势,自商品化的VITEK MS和BioTyper微生物质谱鉴定系统分别于2012和2013年获得美国FDA认证后,短短几年时间该技术得到多领域广泛应用与评价。本论文的技术路线是利用MALDI-TOF MS采集微生物的肽质量指纹图谱,将采集到的指纹图谱与建立的标准指纹图谱库进行检索比对,完成微生物的分类鉴定。围绕上述内容,本论文主要工作包含五个章节:第1章通过与其它分类鉴定技术在原理和特点上的对比,阐述了本课题技术路线的优势及研究意义。目前微生物鉴定方法可分为两大类:传统的表型学鉴定法及分子遗传鉴定法。可从四种水平或层次进行鉴定:1、微生物的形态和生理生化水平,2、微生物细胞组分水平,3、微生物蛋白质水平,4、微生物遗传基因（核酸）水平。着重介绍基于蛋白质水平的MALDI-TOF MS肽质量指纹图谱方法的原理、特点和流程,以及目前主要前沿应用。第2章对指纹图谱获取策略进行了优化研究,首先从提高谱图质量（分辨率）的角度,对离子源和质量分析器的关键结构、电气参数进行优化设计。建立双场加速、延时引出（DE）及考虑离子初始动能分散、空间分散影响下的飞行时间质量分析器（TOF MS）理论模型,在此模型下推导聚焦条件,并提出利用鸟群觅食算法（PSO）进行多变量影响下模型快速求解的计算方法,进行优化设计。在短时间（几分钟）内可同时完成了多个（本文求解5个）仪器重要参数的优化求解,解决了多变量耦合影响下只能进行单一参数优化而无法进行多变量同时优化求解的问题。其次,分析了样本前处理和采集环节对谱图的影响,并利用模糊控制（Fuzzy Control）技术进行自动激光能量调整采集策略评估,谱图质量、重复性优于手动采集,且有利于谱图采集的标准化。第3章进行谱图预处理算法的研究,对比评估了目前文献中多种常用的平滑、基线校正、归一化、特征峰提取、质量轴校准及谱图对齐算法,设计了中值滤波结合小波变换、局部最小值滤波结合多项式拟合的基线校正算法,解决了直接利用小波变换和多项式拟合造成的基线过拟合问题。同时设计了动态校准算法实现了谱图对齐功能,保证了质量轴理论模型的准确性。第4章进行指纹图谱库构建及分类鉴定算法的研究,设计了带有特征加权的主谱图预测（MSP）的构建算法及检索鉴定算法。分别利用欧氏距离、皮尔森（Pearson）相关系数等检索鉴定算法对48株临床常见细菌、真菌进行鉴定,本论文设计的带特征加权的检索鉴定算法准确率100%,平均鉴定分值2.43,优于其它现有算法。建立了利用特征分割的接收者操作特征（ROC）曲线结合支持向量机（SVM）的智能分类模型和基于反向传播神经网络（BP-ANN）的分类模型,实现特征的快速有监督分类。结合32个耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和29个甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）样本进行分型研究,根据ROC提取两个特征峰（6571.92Da与6701.61Da）,再利用线性SVM及4层BP神经网络算法实现了快速准确分类,准确率达到96.77%。第5章通过大量实验对上述仪器及算法设计进行了评估验证。对包含46个属、85个种的696个临床样本数据与现有鉴定算法平行对比测试。本论文设计的带特征加权的差值对比算法对属、种级别鉴定准确率分别为99.86%、94.68%,平均打分分值为2.37分,明显优于目前文献中提及的其它方法。利用不同来源的29个院内感染病原菌数据进行同源性分析,层次聚类（HCA）分类准确率为96.55%。再次利用第4章提到的32个MRSA和29个MSSA样本进行无监督HCA分类,准确率为88.52%。提出了全新的MALDI-TOF MS与FT-IR的联合分型技术。通过对极易混淆的大肠埃希菌与志贺菌属的分型测试,MALDI-TOF MS和FT-IR单一数据谱图的分型准确分别是68%和89%,但是二者联合分型技术的准确率得到大幅度提高,达到了 100%。总之,本论文围绕MALDI-TOF MS微生物肽质量指纹图谱微生物鉴定技术,详细分析了指纹图谱获取的影响因素,对仪器硬件结构、电气参数及获取关键步骤进行分析与优化,重点研究谱图预处理及分类鉴定算法的设计,并通过大量不同类型的实验和数据对上述仪器与算法设计进行评估与验证,完成了该技术从数据获取,到谱图处理,再到数据库构建及鉴定检索,最终进行应用环节关键技术的系统化研究。结果表明,本文设计的MALDI-TOF MS微生物分类鉴定算法优于目前现有参考文献中的相关方法,无论对算法研究还是实际应用均具有较高价值。