论文部分内容阅读
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H. pylori)是慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因子，与胃粘膜淋巴组织淋巴瘤和胃癌的发病密切相关，阐明致病机制对预防和控制其感染引起的相关疾病具有重要的理论指导意义。H. pylori的感染与致病，是一个与机体相互斗争的过程。自噬在抗病原微生物感染以及其导致的炎症中发挥重要作用。自噬受到抑制，可以促进炎性因子的释放，引起炎症反应，导致疾病的发生发展。一方面，H. pylori感染胃上皮细胞可诱导自噬,通过自噬降解病原体或其分泌的毒性分子起到保护胃上皮细胞的作用；另一方面，H.pylori为了达到感染和致病目的，存在某种机制对抗自噬。本研究提出CagA负性调控幽门螺杆菌诱导的胃上皮细胞自噬在慢性胃炎发生中的作用机制： H. pylori感染可活化胃粘膜上皮细胞内肝细胞生长因子(HGF)的受体c-Met,磷酸化c-Met可与通过Ⅳ分泌系统转运至胃上皮细胞内的CagA发生相互作用，启动了其下游的PI3K/Akt信号途径的活化,通过调节自噬通路中的信号蛋白mTOR而发挥抑制自噬的作用，从而影响到自噬对胃上皮细胞保护作用，导致CagA阳性H. pylori菌株胃上皮细胞炎症反应较重，引起慢性胃炎、消化性溃疡，甚至胃癌等疾病。miRNAs作为一类新的癌基因或抑癌基因，其表达失衡与多种肿瘤的发生密切相关。前期研究中，我们通过芯片分析H. pylori感染胃上皮细胞miRNAs的变化，发现与肿瘤发生密切相关的miR-222表达上调，而其靶基因RECK作为一种抑癌基因，可以负性调控基质金属蛋白酶(MMP)，抑制肿瘤的生长和转移，其在胃癌组织和细胞株中表达缺失，与胃癌的预后呈负相关。因此，我们推测miR-222可能是一个与H.pylori感染和胃癌发生密切相关的癌基因。H. pylori感染能够诱导miR-222的高表达，而miR-222可能通过抑制下游抑癌基因RECK的表达，调控细胞的增殖和凋亡，促进胃癌的发生和转移。H. pylori可以在人体特殊的复杂多变的胃环境中长期定居，其慢性持续性感染在所致疾病的发生发展中发挥着重要作用。近年来，越来越多的证据显示miRNAs在多个环节参与调控机体固有免疫应答和获得性免疫反应，在宿主抗病原微生物感染时扮演重要的角色。前期研究发现H. pylori感染相关的miR-146a通过抑制靶基因IRAK1、TRAF6和COX-2的表达，降低NF-κB的活性，从而抑制H. pylori感染导致的炎症因子的释放。为深入研究在H. pylori感染诱导miR-146a表达过程中究竟什么因素起关键作用，我们观察了H. pylori感染相关炎性细胞因子以及H. pylori毒素蛋白CagA在胃上皮细胞中对miR-146a表达的影响。【研究目的】1.评价H. pylori感染胃上皮细胞诱导自噬发生的过程中CagA对自噬的抑制作用；观察自噬抑制对H. pylori感染引起的炎症反应的影响；探讨CagA负性调控H. pylori诱导的胃上皮细胞自噬的机制。2.分析H. pylori感染胃上皮细胞、胃粘膜组织以及胃癌细胞株、胃癌组织中miR-222的表达；筛选并鉴定miR-222的靶基因，探讨其致癌机制。3.观察H. pylori相关炎性因子IL-8、TNF-α以及IL-1β刺激HGC-27细胞对miR-146a表达影响；评价miR-146a对H. pylori感染诱导炎症因子释放的影响；探讨毒力因子CagA对H. pylori感染诱导miR-146a的表达影响。【研究方法】1.幽门螺杆菌CagA抑制胃上皮细胞自噬及其在慢性胃炎发生中的作用机制研究Western-blot、激光共聚焦、电镜以及流式细胞技术分别检测Hp-WT或Hp-△CagA感染人胃上皮细胞自噬模型和临床胃粘膜标本自噬水平；检测体外过表达CagA对Rapamycin诱导自噬的影响；使用化学药物法抑制自噬或利用siRNA技术阻断自噬，ELISA分别检测Hp-WT和Hp-△CagA两种菌株感染诱导炎症因子分泌的水平，荧光素酶法检测NF-κB荧光素酶报告基因活性；Western-blot检测PI3K/Akt/mTOR信号途径是否参与了H. pylori感染过程中CagA对自噬的抑制作用；利用siRNA沉默c-Met表达，Western-blot、激光共聚焦显微镜、流式细胞技术检测H. pylori感染诱导的自噬情况。2. miR-222高表达在幽门螺杆菌感染诱发胃癌中的作用及机制研究RT-PCR检测H. pylori感染胃上皮细胞系前后以及H. pylori感染患者胃粘膜组织、胃癌细胞株以及胃癌组织中miR-222的表达；CCK-8法检测miR-222对两种胃癌细胞株增殖的影响，分析miR-222对两种胃癌细胞株克隆形成的影响；利用双荧光素酶实验、GFP荧光抑制实验、Western blot鉴定靶基因；利用RT-PCR技术检测靶基因与miR-222胃癌组织样本中的表达水平及相关性；CCK-8法和克隆形成实验分别检测沉默RECK表达是否可以模拟过表达miR-222对胃癌细胞AGS增殖和克隆形成的影响。3. H. pylori感染HGC-27细胞miR-146a表达调节机制初步研究利用RT-PCR技术检测IL-8、TNF-α以及IL-1β刺激HGC-27细胞后miR-146a表达情况；siRNA沉默IL-8、TNF-α和IL-1β的表达，RT-PCR技术检测H. pylori感染后miR-146a表达；荧光素酶法检测IL-8、TNF-α或IL-1β刺激后NF-κB荧光素酶报告基因活性；分别用IL-8、TNF-α或IL-1β刺激NF-κB抑制剂(BAY-117082)处理过的HGC-27细胞，RT-PCR技术检测miR-146a表达；RT-PCR和ELISA技术分别检测过表达miR-146a对H.pylori感染炎症因子mRNA和蛋白水平； CagA阳性或阴性H. pylori菌株感染HGC-27细胞，RT-PCR技术检测miR-146a表达；转染HGC-27细胞pEGFP-C1-CagA质粒，荧光显微镜和免疫印迹检测转染效率，RT-PCR技术检测内源性高表达CagA对miR-146a的表达影响。【主要结论】1. CagA具有抑制H. pylori诱导胃上皮细胞自噬的作用；抑制自噬可以增强Hp-△CagA感染介导的炎症程度；CagA可能通过PI3K/Akt/mTOR信号途径介导了H. pylori感染过程中对自噬的抑制作用；c-Met分子可能参与了CagA抑制H. pylori感染胃上皮细胞自噬过程。2.无论是体外还是体内H. pylori感染均能诱导miR-222的表达上调；miR-222在胃癌细胞株和胃癌组织中均呈高表达；RECK为miR-222的新靶基因；H. pylori感染诱导的miR-222的高表达，可能通过靶向抑制RECK蛋白的表达，来发挥促进肿瘤细胞增殖的作用；胃癌组织中，miR-222与RECK转录水平表达量呈现很好的负相关。3. H. pylori相关炎性因子刺激胃上皮细胞HGC-27诱导miR-146a表达上调，但对于miR-146a的高表达为非必要条件； NF-κB活化参与了IL-8、 TNF-α以及IL-1β诱导miR-146a高表达；过表达miR-146a可以抑制H. pylori感染相关炎症因子的释放；H.pylori感染对miR-146a的诱导不依赖于毒素蛋白CagA。【研究意义】1.本研究首次提出幽门螺杆菌CagA作为一种负性调控因子，通过抑制自噬引起慢性胃炎的新观点，并在体内外从现象到机制进行了探讨，为深入理解和认识H. pylori慢性感染致病机制、寻找H. pylori感染有效防治手段提供了新的视角。2. miR-222可能参与H. pylori感染诱发胃癌的过程，可以作为胃癌诊断或治疗的靶点，在H. pylori感染与胃癌形成的过程中发挥调节作用，研究为阐明H. pylori的致癌机制提供了新线索。3. H. pylori感染引起的炎症免疫反应调控机制十分复杂且涉及诸多环节。miRNAs在H. pylori感染的免疫调节中发挥重要作用。本文对H. pylori感染诱导miR-146a表达的调节机制予以了初步探索，miR-146a可能成为H. pylori感染诊断、治疗和预后的新靶点。