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本研究以奶牛β-酪蛋白基因调控区为指导元件，以人组织型纤溶酶原激活剂指形区缺失体(t-PA指形区缺失体)为表达序列，构建了乳腺特异性表达载体pEBT。转染牛耳成纤维细胞，筛选获得稳定表达株。在载体pEBT的基础上，加入牛乳腺核基质附着区(BMARs)和人α-丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的核基质附着区(HMARs)，构建成另外两个t-PA指形区缺失体乳腺特异性表达载体pBEBT和pHEBT。为利用体细胞核移植技术生产牛乳腺生物反应器，提供高效表达t-PA指形区缺失体的细胞株。相关结果如下：1.通过RT-PCR技术成功的从人胎盘组织中扩增出长度为1640bp的人t-PA指形区缺失体cDNA，其中包含完整的编码序列。序列分析表明，片段与GenBank中登录的人t-PA指型区缺失区体cDNA序列的同源性为99﹪。在读码框内，只有三个碱基发生点突变。2.利用定向克隆的方法，将t-PA指形区缺失体表达序列克隆到初级乳腺表达载体pBCP上，然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中，最终构建了t-PA指形区缺失体乳腺特异性表达载体pEBT。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，并报告基因和目的基因表达为非融合型表达。3.通过脂质体法将表达载体pEBT转入体外培养的牛耳成纤维细胞，经G418抗性筛选，得到可稳定地表达绿色荧光蛋白的阳性细胞，但表达量偏低。4.利用PCR技术扩增了牛乳腺核基质附着区，全长1190bp。。5.将牛乳腺核基质附着区(BMARs)定向克隆至pEGFP-C1载体中EGFP的下游，构成重组载体pBE。并在牛乳腺核基质附着区的上游引入终止密码子TAA，确保表达的EGFP为非融合蛋白。将pBE载体转染分离培养的牛耳成纤维细胞，经G418抗性筛选后得到的稳定克隆在荧光显微镜下观察，表明BMARs确实可提高基因的表达效率。6.以重组表达载体pBE和pHE(pEGFP-Cl-HMARs)为基础构建了t-PA指形区缺失体乳腺特异性表达载体pBEBT和pHEBT。目的是通过核基质附着区克服位置效应，转染后可获得高效表达株。7.采用分段PCR法，分三段克隆了长约9.7kb的牛β-酪蛋白基因序列。包括1.7kb的5′侧翼序列、前八个外显子及第八个内含子的部分序列。经NCBIblastn软件进行同源性序列分析。