第一部分载吲哚菁绿和全氟溴辛烷脂质纳米粒LIP-PFOB-ICG的制备及性能检测目的制备载吲哚菁绿(Indocyanine green,ICG)和全氟溴辛烷(Perfluoroctyl bromide,PFOB)的脂质纳米造影剂(LIP-PFOB-ICG),检测其基本的理化性质、携氧能力、光热性能及光动力性能。方法采用薄膜水化-双乳化法制备LIP-PFOB-ICG脂质纳米造影剂,并检测该脂质体基本的理化性质,包括粒径、电位、形态结构、紫外吸收光谱和携氧能力。在808 nm激光辐照下,检测不同激光功率和不同ICG浓度条件下该脂质体的光热特性。分别在正常条件和乏氧条件下,检测不同激光辐照时间和不同ICG浓度下该脂质体的光动力特性,并用激光共聚焦观察该脂质体在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞中产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的能力。结果用双乳化法制备的LIP-PFOB-ICG脂质体呈绿色乳液,透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)下观察到该脂质体为壳-核球形结构,大小均一,分散度好。马尔文粒径仪检测LIP-PFOB-ICG脂质体在激光辐照前后的平均粒径分别为319.1 nm和348.7 nm,测得的平均电位分别为-37.33 m V和-36 m V。在室温在放置7天,粒径和电位均无明显的改变,证明了该脂质体的稳定性高。紫外吸收光谱显示LIP-PFOB-ICG脂质体在810 nm有强吸收峰,并测得ICG的包封率为80%,载药量为7.41 wt%。在激光共聚焦下观察LIP-PFOB-ICG脂质体的形态,大部分Di I标记的LIP-PFOB脂质体的红色荧光和ICG的绿色荧光融合呈黄色荧光,也证明该脂质体成功的包裹了ICG。由于PFOB有较强的溶氧能力,可以观察到加入LIP-PFOB-ICG和LIP-PFOB脂质体后,水溶液中的氧浓度迅速增加并维持高浓度水平。给予808 nm激光辐照后,LIP-PFOB-ICG脂质体升温效果明显,与ICG的浓度以及激光功率呈良好的线关系。ICG包裹在脂质体内后,其光热稳定性也明显增加。体外光动力结果显示,LIP-PFOB-ICG脂质体在富氧和缺氧条件下均能产生大量的活性氧,并且和ICG浓度以及激光辐照时间呈线关系。证明了PFOB的引入可以有效地提高ICG的光动力效果。结论通过薄膜水化-双乳化法成功地制备了LIP-PFOB-ICG脂质体。该脂质体形态规则,大小均匀,稳定性好,载药量较高,具有良好的携氧能力,光热效果和光动力效果,为乳腺癌成像和治疗奠定了基础。第二部分载吲哚菁绿和全氟溴辛烷脂质纳米粒LIP-PFOB-ICG的多模态显像研究目的观察LIP-PFOB-ICG脂质纳米造影剂体外增强近红外荧光成像(Fluorescent imaging,FL)、光声成像(Photoacoustic imaging,PA)和电子计算机断层扫描(Computed tomography,CT)的成像效果,并研究其在裸鼠乳腺癌移植瘤FL,PA,CT三模态成像的效果。方法将LIP-PFOB-ICG脂质体根据ICG的浓度稀释为1.5-25μg/m L,在Xenogen IVIS生物发光成像系统中采集荧光图像。将LIP-PFOB-ICG脂质体根据ICG的浓度稀释为0-400μg/m L,在Vevo Laser光声成像系统中采集光声图像。配置不同浓度的LIP-PFOB-ICG脂质体(0.5-8 mg/m L),在micro-CT成像系统中采集CT图像。最后在各个成像系统中检测相应的信号强度。建立裸鼠MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤体积大约长至100 mm3时开始实施体内FL/PA/CT三模态成像实验。在体内荧光成像和光声成像中,把荷瘤裸鼠随机分为三组,分别为游离ICG组,LIP-ICG组和LIP-PFOB-ICG组(ICG的浓度均为800μg/m L),在尾静脉给药0,6,24和48小时后采集活体荧光图像和光声图像。在体内CT成像实验中,把荷瘤裸鼠随机分为两组,分别为LIP-PFOB组合LIP-PFOB-ICG组(脂质体的浓度均为10 mg/m L),在尾静脉给药0,6,24,48和96小时后采集CT图像。结果在体外荧光成像中,当ICG浓度为3.5μg/m L时,荧光信号最强,随着ICG浓度增加,荧光信号逐渐减弱。而体外光声成像和CT成像结果显示,LIP-PFOB-ICG脂质体可明显增强光声和CT成像,且光声信号和CT密度值分别随着ICG的浓度和脂质体浓度的增加而增强,呈良好的线性相关。在MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型的体内成像实验中,LIP-PFOB-ICG和LIP-ICG脂质体通过高通透性和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应在肿瘤部位逐渐富集,荧光信号和光声信号随时间推移而逐渐增强,在给药24小时后达到最高峰,且两组之间的荧光信号和光声信号均无明显的统计学差异。而在游离的ICG组中,肿瘤部位未见明显的荧光和光声增强显影。LIP-PFOB-ICG和LIP-ICG脂质体组中,肿瘤部位的荧光信号和光声信号在给药24小时后和游离ICG组的比较,差异显著(p<0.05)。体内CT成像实验结果显示,LIP-PFOB和LIP-PFOB-ICG脂质体也逐渐在肿瘤部位聚集,在给药24小时后CT信号最强,并且该显影效果可持续到48小时,96小时后才逐渐降低。LIP-PFOB和LIP-PFOB-ICG两组间组肿瘤部位的CT信号强度无明显统计学差异。结论制备的LIP-PFOB-ICG脂质纳米造影剂具备荧光/光声/CT三模态显影能力,并且可以通过EPR效应在肿瘤组织中富集,增强乳腺癌移植瘤的荧光、光声及CT显影,是一种良好的多模态造影剂。第三部分载吲哚菁绿和全氟溴辛烷脂质纳米粒LIP-PFOB-ICG对乳腺癌治疗作用的实验研究目的研究LIP-PFOB-ICG脂质体的光热治疗(Photothermal therapy,PTT),光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)及光热联合光动力治疗乳腺癌的效果,其相关机制以及LIP-PFOB-ICG脂质体的生物安全性评估。方法在无激光辐照条件下,将不同浓度的LIP-PFOB-ICG脂质体与乳腺癌细胞系MDA-MB-231共同孵育24小时后,用CCK-8法检测细胞的存活率。给予808 nm激光辐照,分别在富氧和缺氧条件下,检测不同浓度LIP-PFOB-ICG脂质体的光毒性。并且用CCK-8法和钙黄绿素(Calcein-AM,CAM)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)双染色法分别检测该脂质体的PTT效果,PDT效果以及PTT联合PDT的协同治疗效果。建立MDA-MB-231乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤体积长至100 mm3时开始给予不同的治疗。把荷瘤裸鼠随机分成10组,1.对照组(生理盐水),2.激光组,3.游离ICG组,4.游离ICG+激光组,5.LIP-ICG组,6.LIP-ICG+间断激光组(30 s开,30 s关),7.LIP-ICG+连续激光组,8.LIP-PFOB-ICG组,9.LIP-PFOB-ICG+间断激光组(30 s开,30s关),10.LIP-PFOB-ICG+连续激光组。其中2、4、6、7、9、10组,在给药24小时后给予相应的激光辐照,用红外成像仪记录肿瘤部位的升温情况。经过不同的处理后,观察裸鼠的体重和肿瘤体积大小。3天后,每组随机处死2只裸鼠,收集心、肝、脾、肺、肾、脑和肿瘤组织进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,并对肿瘤组织进行PCNA和TUNEL免疫组化染色检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。为检测PFOB改善肿瘤部位乏氧状态的效果,把荷瘤裸鼠随机分为4组,分别为对照组,LIP-ICG组,LIP-PFOB组和LIP-PFOB-ICG组,检测肿瘤部位处理前后血氧饱和度和低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的改变。为研究增强的光动力效果是否对光热治疗效果有影响,把荷瘤裸鼠随机分为5组,分别为对照组,LIP-ICG组,LIP-PFOB-ICG组,LIP-ICG+激光组,LIP-PFOB-ICG+激光组,用免疫荧光法和蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)检测热休克蛋白70(Heat Shock Protein70,HSP70)的表达。为例评估LIP-PFOB-ICG脂质体的生物安全性,在各个治疗组处理3天后,每组随机挑选2只裸鼠,收集重要脏器进行HE染色,观察有无形态结构改变。并取25只昆明鼠,通过尾静脉给予LIP-PFOB-ICG脂质体(10 mg/m L),在给药1,7,14和28天后取血化验各项血液指标。结果无激光辐照下,LIP-PFOB-ICG脂质体对乳腺癌细胞无明显的细胞毒性。而给予激光辐照后,LIP-PFOB-ICG脂质体对乳腺癌细胞有明显的光毒性,且随着ICG浓度的增加而增强。当ICG浓度为12.5μg/m L时,单纯PDT治疗后细胞活性为52%,单纯的PTT治疗后细胞活性为18%,而PDT协同PTT治疗后的细胞活性仅为7%。体内治疗结果显示,LIP-ICG+连续激光组和LIP-PFOB-ICG+连续激光组给予激光辐照后,肿瘤部位的温度迅速上升,最高温度分别达到47.4℃和48.1℃,同时产生了光热效果和光动力效果。而LIP-ICG+间断激光组和LIP-PFOB-ICG+间断激光组给予激光辐照后,由于肿瘤部位的温度控制在43℃以下,避免了光热效果,因此可作为单纯光动力治疗。经不同的处理18天后,LIP-ICG+间断激光组中肿瘤生长未受到明显的抑制作用,和对照组的肿瘤生长无明显差异。在LIP-PFOB-ICG+间断激光组中,肿瘤生长受到了一定程度的抑制。而LIP-ICG+连续激光组中,肿瘤生长在治疗初受到了抑制但8天后肿瘤复发,最终只有给予LIP-PFOB-ICG+连续激光处理后,裸鼠的肿瘤生长受到了完全抑制,且没有复发。在该处理组的肿瘤组织HE切片中,可见大量坏死,无完整细胞结构,镜下呈红染无结构区,且相关免疫组织化学染色结果显示该组肿瘤组织的增殖指数最低,凋亡指数最高。检测肿瘤组织的乏氧状态,可以观察到给予LIP-PFOB和LIP-PFOB-ICG脂质体后,肿瘤部位的血氧饱和度上升,HIF-1α的表达明显降低,证明PFOB的引入可以一定程度地改善肿瘤部位的乏氧状态。HSP70免疫荧光和WB结果均显示LIP-PFOB-ICG+连续激光组的HSP70表达较LIP-ICG+连续激光组的表达降低,证明ICG增强的光动力效果可以一定程度上抑制HSP的表达,从而增强光热治疗效果。各组主要器官的HE染色均未见明显异常。且给予LIP-PFOB-ICG脂质体后,不同时间点的血液指标与对照组无明显区别,证明了该脂质体的生物安全性。结论制备的LIP-PFOB-ICG脂质体可以一定程度改善肿瘤的乏氧状态,增强ICG的光动力治疗效果,减少HSP70的表达,从而增强ICG的光热治疗效果。LIP-PFOB-ICG脂质体的光热协同光动力治疗可以完全抑制肿瘤生长,为乳腺癌治疗提供一种新途径。