腱/韧带是坚韧的结缔组织,它们通过其结构、力学性质和外形的变化以响应外力的刺激,在运动中起着重要作用,但活动范围超过极限或拉扯过剧,腱/韧带常常会受到损伤甚至断裂,严重影响人们的健康。腱/韧带损伤的治疗目前仍然是整形外科中具有挑战性的问题,比如如何加快治疗速度、提高治疗质量直至完全治愈等等,都是临床上亟待解决的难题。骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有增殖和多向分化潜能的特殊细胞。在特定条件下,MSCs在体外可增殖并分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞等。这种增殖能力和分化可塑性为临床上腱/韧带损伤组织的修复带来了希望,使腱/韧带创伤的治疗甚至组织工程化成为可能。MSCs的自我更新和分化行为高度依赖于其所处的特殊局部微环境。已有研究证明各种理化因素刺激或特殊细胞微环境对MSCs的增殖、分化等生物学行为起着重要的调节作用,但MSCs在腱/韧带细胞微环境下的增殖、分化行为特征及其相关规律人们还不清楚,有关这方面的研究不仅具有重要的理论意义,而且具有潜在的应用价值。为此,本实验采用Transwell system建立大鼠MSCs与大鼠肌腱细胞体外共培养模型模拟肌腱细胞微环境,并采用生物化学、分子生物学技术考察肌腱细胞微环境对大鼠MSCs增殖和腱/韧带相关基因表达的影响。主要研究工作和结果如下:1.大鼠MSCs和肌腱细胞的原代分离培养利用密度梯度离心结合差异贴壁法进行大鼠MSCs的原代分离培养,结果显示:1.073 g/mL的percoll密度梯度离心结合差异贴壁分离得到的细胞为形态比较均一的单核细胞,用含10%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)的DMEM培养基培养24小时后细胞开始贴壁,继而分裂增殖,呈集落式生长,约2周后接近融合,呈纺锤形或长梭形的成纤维细胞样形态。其间有漂浮不贴壁的造血细胞等杂细胞,可在多次换液中被除去。待细胞融合后用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化传代。通过组织块爬片法进行肌腱细胞的原代分离培养。无菌分离大鼠前肢肌腱组织,剪成小块,在DMEM培养基中培养大约一周,即可见细胞爬出,呈典型的长梭形,形态均一,细胞光滑,顺胶原纤维的长轴成行排列,约两周在组织块周围形成漩涡状集落,细胞呈长梭形或菱形。2.大鼠MSCs的鉴定姬姆沙染色显示培养细胞胞核呈圆形或椭圆形,为紫色,可见数个深紫色的核仁,胞浆为淡紫色。利用免疫染色方法考察细胞表面相关抗原的表达,利用流式细胞技术分析了细胞周期的分布。结果发现:细胞表面抗原CD34(造血干细胞标记物)呈阴性,CD44和CD29呈阳性表达。细胞周期分析显示G0/G1期细胞占(89.74±3.87)%,S期细胞占(2.49±2.20)%,G2/M期细胞占(7.70±3.70)%,表明大部分细胞呈非增殖状态,符合干细胞的特征。3.肌腱细胞微环境对MSCs增殖的影响本文首先通过MTT法测定了大鼠MSCs的生长曲线,分析了MSCs与肌腱细胞共培养1-7天后MSCs的增殖行为变化情况,其次通过RT-PCR技术检测了MSCs在肌腱细胞共存微环境下c-fos基因表达的变化。结果显示:第1-2天为MSCs生长潜伏期,第3-7天为对数增长期,7天以后细胞的生长进入平台期。在共培养的前两天,共培养组和对照组(MSCs单独培养)细胞的增殖行为没有明显差异。从第3天开始共培养组MSCs的增殖加快,与对照组相比有显著性差异。细胞形态观察也发现共培养组MSCs的生长情况好于对照组。RT-PCR检测结果显示:与肌腱细胞共培养4天,共培养组c-fos基因的表达高于对照组,共培养7天c-fos基因表达显著高于对照组。这些结果表明,肌腱细胞微环境对MSCs的增殖起促进作用。4.肌腱细胞微环境对MSCs腱/韧带相关基因表达的影响本文将肌腱细胞与MSCs共培养,观察肌腱细胞微环境对MSCs分化的诱导。分别在共培养7、14、21天提取MSCs的总RNA,采用RT-PCR技术检测腱/韧带发育相关的四个关键基因Collagen I (Col I)、Collagen III (Col III)、Tenascin(TNC)、Scleraxis(SCX)的表达变化。实验结果显示:共培养7天,腱/韧带相关四个基因的表达均有一定程度的增加,但是与对照组相比并没有显著性差异;随着培养时间的延长,分别共培养14和21天后,四个基因的表达量持续增加,与对照组相比均呈现出显著性差异,并与大鼠肌腱细胞中四个相应基因的表达情况进行了比较。从细胞形态观察,共培养21天后MSCs由纺锤型逐渐向规则的棱形转变,细胞均一性好,排列整齐,与分离培养的肌腱细胞形态更加相似。实验结果表明:肌腱细胞微环境能促进MSCs上腱/韧带相关基因的表达,提示MSCs在肌腱细胞微环境诱导下具有向肌腱细胞定向分化的趋势。本文的研究结果表明,肌腱细胞微环境对大鼠MSCs的增殖和分化行为起着重要的调节作用。肌腱细胞微环境不仅可以促进MSCs增殖,而且可以促进MSCs上腱/韧带相关基因的表达,诱导MSCs向腱/韧带细胞方向分化。这些实验结果为临床上腱/韧带创伤的治疗及其组织工程化相关研究提供了理论基础和方法学参考。