CD47又称整合素相关蛋白,是一个五次跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员。CD47作为最重要的“自我”识别分子表达于大多数细胞表面。另外,CD47在免疫识别尤其是固有免疫识别中也发挥着关键作用,被认为是调节固有免疫的检验点分子。CD47与骨髓来源的固有免疫细胞尤其是巨噬细胞表面的免疫负调控分子,信号调节蛋白α(Signal regulatory protein alpha,SIRPα)结合,可以抑制巨噬细胞的吞噬作用。近年来发现CD47也在大多数肿瘤中过表达,是肿瘤逃避免疫攻击的机制之一。因此,阻断CD47与SIRPα的结合对于恢复抗肿瘤免疫反应,从而获得有效的肿瘤免疫治疗是一个非常有希望的治疗策略。最近采用抗CD47单克隆抗体和SIRPα模拟物在小鼠肿瘤模型中证明,阻断CD47与SIRPα的结合可以有效清除包括白血病、淋巴瘤和乳腺癌、结肠癌、膀胱癌、黑色素瘤、肝癌、非小细胞肺癌等多种实体瘤细胞,明显抑制肿瘤的生长和转移,并显著延长荷瘤小鼠的存活期,具有令人鼓舞的治疗效果。食管癌在我国是一种高发肿瘤,其发病率和死亡率居前五位。目前没有有效的治疗手段。另外,目前也未见针对食管癌CD47的研究和治疗报道。因此,在本研究中,制备了一种基因工程改造的单链抗体和源自骆驼重链可变区的纳米抗体,分析这两种抗体对CD47结合SIRPα的阻断作用,并探讨其对巨噬细胞吞噬作用的影响,评价这些小分子抗体对食管癌的治疗作用,从而发展一种新的针对食管癌固有免疫检验点的治疗方法,为改善食管癌的治疗做出贡献。本研究内容主要分为三部分:1.抗CD47纳米抗体和单链抗体的制备首先,采用人CD47全长基因通过PCR技术扩增获得CD47的胞外区(ECD)基因,构建到p ET30a上。原核表达系统表达重组CD47蛋白并鉴定构建好的重组CD47抗原。其次,采用噬菌体展示文库技术亲和筛选抗CD47的纳米抗体。构建重组CD47的噬菌体展示文库,经过2轮的亲和淘洗,获得了与重组CD47-ECD高亲和力的纳米抗体VHH-2B1。将VHH-2B1亚克隆到p ET22b载体上,获得抗CD47的纳米抗体;第三,采用DNA合成方法,将抗CD47的单克隆抗体B6H12的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),通过短肽(Gly4Ser)3连接形成B6H12单链抗体(B6H12-sc Fv),亲和层析法纯化获得抗CD47的单链抗体B6H12-sc Fv。结果表明,成功的构建了p ET30a-CD47质粒,诱导表达获得重组CD47蛋白。通过噬菌体展示文库筛选技术获得了抗CD47的3个纳米抗体。又通过基因合成的方法获得抗CD47的单链抗体B6H12-sc Fv。2.抗CD47抗体在体外的结合活性分析及对食管癌细胞的促吞噬作用首先制备抗CD47小分子纳米抗体和单链抗体,验证抗体结合活性和体外功能方面的作用。ELISA和Western blot方法检测其与CD47的结合。同时,采用竞争ELISA分析B6H12-sc Fv对CD47与SIRPα结合的阻断能力和食管癌细胞中CD47的表达水平分析及单链抗体对食管癌细胞的促吞噬作用。结果表明,筛选出的纳米抗体VHH-2B1与抗原具有与结合活性,亲和系数4.76×10-8mol/L。ELISA和流式细胞检测结果表明B6H12-sc Fv与食管癌细胞EC9706表面CD47较好结合,而与原核表达的人CD47抗原结合活性较低。B6H12-sc Fv也可以竞争性阻断CD47与SIRPα的结合,且可以促进巨噬细胞吞噬EC9706细胞。3.抗CD47抗体对人食管癌异种移植瘤裸鼠的抑制作用首先,培养EC9706的食管癌细胞,免疫Balb/c裸鼠,每只裸鼠注射EC9706细胞,建立食管癌裸鼠模型。其次,制备纳米抗体VHH-2B1及B6H12-sc Fv,每周免疫两次,空白对照组小鼠免疫DPBS。最后,每周测量肿瘤的体积,称取瘤块质量,利用统计学分析显著性差异,发现并没有显著性差异(P>0.05)。体内实验结果表明,利用抗CD47的抗体对食管癌小鼠进行治疗,未达到预期的治疗效果。本研究主要通过体内体外的实验验证制备的抗CD47抗体的治疗作用。体外实验表明制备的抗CD47的抗体与CD47抗原具有结合活性。体内实验中,建立了食管癌小鼠模型,利用抗CD47的抗体治疗,但是没有达到预期的治疗效果。究其原因可能是制备的抗体为小分子抗体,与单抗先比缺少糖基化的位点,在体内代谢时间短,治疗不易产生效果。其次,制备的抗体具有结合活性,但是结合活性还是较弱,导致治疗效果不明显。本研究,成功的制备了抗CD47的抗体,验证了其功能,为食管癌的治疗提供了新的依据。