研究背景新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是指围产期窒息导致大脑缺氧缺血性损害,临床出现一系列中枢神经系统异常的表现。它是围产期大脑损伤及遗留远期神经系统后遗症的主要原因。其发病机理是多因素共同参与的过程,细胞凋亡是导致围产期脑损伤的主要原因。对围产期HIE的研究大多是利用动物模型模拟疾病的病理过程来开展。尽管大量的研究工作,但是对急性神经系统疾病仍然没有被广泛认可的神经保护药物疗法。因此,寻找有效的缓解神经损伤的治疗策略至关重要。内质网是蛋白合成及钙储存的主要场所。蛋白构象异常是细胞内稳态失衡的主要原因,内质网功能紊乱将引起蛋白质构象异常,最终导致疾病及发育异常的发生。缺氧、缺血／再灌注、氧化应激、ATP耗竭、钙调节紊乱等刺激引起内质网功能紊乱,内质网膜未折叠蛋白过度累积,导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS) 。细胞在非应激状态下,葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)分别与蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase, PERK)、肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1, IRE1)及活化转录因子6(activating transcription factor 6, ATF6)结合。应激状态下,错误折叠蛋白使GRP78从三个跨膜蛋白中解离出来,激活一系列信号转导级联反应,使内质网功能恢复到生理状态,称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)。然而,如果ERS反应过于严重和持久,那么UPR也能启动凋亡途径。通常GRP78被广泛认为是ERS病理状态标志蛋白,GRP78表达水平反应ERS反应程度。ERS在一系列神经系统疾病中发挥作用,例如神经推行性疾病、大脑缺血、脊髓损伤、硬化及糖尿病神经病变等。近年来的研究表明,ERS介导的细胞凋亡途径在脑缺血／再灌注损伤中占据重要作用,但在新生儿HIE中研究较少。生长停滞与DNA损害可诱导蛋白(growth arrest and DNA damage-inducible protein 34, GADD34)是一种细胞周期调节蛋白,在DNA损害、细胞周期停滞及内质网功能障碍等情况下表达上调,直接参与凋亡过程。它也是PERK通路中一个下游蛋白。PERK通路激活后,磷酸化α亚基真核翻译起始因子2(eukaryotic translation initiation factor 2a, eIF2a),抑制蛋白翻译,启动凋亡信号。磷酸化的eIF2a选择性地翻译ATF4,使ATF4表达上调,进而诱导下游蛋白GADD34及C/EBP同源蛋白(CC AAT/enhancer binding protein homologous protein, CHOP)表达。另外,GADD34反过来使eIF2a去磷酸化,从而恢复蛋白翻译功能,阻止蛋白合成抑制(protein synthesis inhibition, PSI),这可能有利于UPR时细胞内稳态的维护。因此,推断GADD34对细胞凋亡可能存在某种调控作用,然而其在新生儿HIE中表达的变化及作用尚不明确。牛磺酸(2-氨基乙磺酸)是一种抑制性神经递质,在新生儿脑中含量最高,随着脑发育成熟逐渐降至成人水平。具有多种生理功能,通过抗凋亡、抗氧化应激、抗炎、抑制谷氨酸诱导的兴奋性毒性等发挥神经保护作用,长期少量补充牛磺酸能预防年龄相关的认知功能下降。近年来,在大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery Occlusion, MCAO)脑卒中模型以及原代神经元缺氧／复氧损伤研究中发现牛磺酸可通过抗ERS发挥神经保护作用。斑马鱼是一种广泛应用于生物医学领域和进化生物学研究的脊椎动物模式生物,其在遗传发育学、功能基因组学、水生生物毒理学、神经科学以及其他许多生物医学研究领域中占有重要作用。斑马鱼大规模的基因筛查已经确定了上百种突变表型,其中有许多跟人类临床疾病相似。由于关键基因试剂的创建,再加上由美国国立卫生研究院建立的斑马鱼基因组学计划的快速发展,迅速将这个模式生物推上了脊椎动物生物学、生理学以及人类疾病研究领域。本课题组前期研究发现,缺氧／复氧可引起斑马鱼胚胎脑部c-fos基因表达上调,可能是导致缺氧后期脑细胞凋亡激增的机制之一；而UPR通路中的一个下游蛋白c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase, JNK)可通过磷酸化c-fos诱发细胞凋亡。后来经牛磺酸处理(浓度分别为1mmol/L、5mmol/L及10mmol/L)缺氧／复氧损伤斑马鱼幼鱼发现,缺氧／复氧可诱发ERS,且牛磺酸能通过下调GRP78、CHOP及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine-asparate protease, caspase-12)表达,减少神经细胞凋亡,缓解斑马鱼幼鱼缺氧／复氧性脑损伤。本研究以新型模式生物斑马鱼为研究对象,牛磺酸浓度为10mmol/L,设5个不同观察时间点,参照文献制备缺氧／复氧损伤模型,模拟新生儿HIE病理发展过程,通过观察神经细胞凋亡,ERS标志蛋白GRP78及通路下游信号蛋白GADD34表达的动态变化,进一步探索ERS在缺氧／复氧性脑损伤斑马鱼幼鱼中的作用以及牛磺酸神经保护作用机制。研究目的和意义1.利用在密闭水族箱中充入氮气(N2)降低水中溶解氧浓度(dissolve oxygen,DO)的方法,制备斑马鱼幼鱼缺氧／复氧性脑损伤模型,模拟新生儿HIE病理发展过程,对疾病发生机制的深入探索、新通路的发现及新药物的高通量筛选具有重要的作用。2.通过比较正常及缺氧／复氧损伤后斑马鱼幼鱼不同时间点神经细胞凋亡指数变化情况,ERS标志蛋白GRP78及通路下游信号蛋白GADD34表达的动态变化,探讨ERS在斑马鱼幼鱼缺氧／复氧性脑损伤病理生理过程中的作用,为治疗新生儿HIE提供新的治疗方向。3.通过观察应用牛磺酸后缺氧／复氧损伤斑马鱼幼鱼神经细胞凋亡指数变化情况及GRP78、GADD34表达的动态变化,探讨牛磺酸神经保护作用机制。研究方法1.将受精后5天(5 day post-fertilization,5dpf)的斑马鱼幼鱼随机分为对照组、缺氧/复氧模型组(缺氧后进行复氧)以及牛磺酸处理组(缺氧后1 Ommol/L牛磺酸处理),各组按照造模后不同观察时间点又分为1h、3h、6h、24h及48h 5个亚组,每亚组100条。2.利用在密闭水族箱中充入N2降低水中DO的方法,制造幼鱼缺氧环境,建立斑马鱼幼鱼缺氧/复氧性脑损伤模型。当水中DO<0.3mg/L时,将幼鱼放入水中,缺氧终止时间点为幼鱼沉于水底静止不动达1min(除了偶尔鳃盖骨的活动),达到缺氧终止时间点后迅速将幼鱼捞出,放入装有养鱼用循环水或者牛磺酸溶液的培养皿中。3.观察缺氧后斑马鱼幼鱼的行为和形态变化,记录模型组和牛磺酸组复氧后苏醒时间(即幼鱼自缺氧终止时间点至出现第一次游动的时间),统计对照组、模型组及牛磺酸组造模后30天中位生存时间和死亡率。4.采用荧光原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL)法检测各组相应时间点脑组织细胞凋亡情况。5.采用反转录实时荧光定量PCR (reverse transcription real-time quantitative PCR, RT-qPCR)法检测各组相应时间点脑组织GRP78、GADD34 mRNA表达水平,免疫印迹法(Western blot)检测GRP78、GADD34蛋白表达水平。结果1.各组斑马鱼幼鱼行为及形态变化：斑马鱼幼鱼进入DO<0.3mg/L水中后,刚开始聚集在水的上层游动；5～8min出现泳姿失衡,身体与水平不平行,无规律的向四处游动；8min后开始出现垂直下落,逐渐下落至水的底层活动,时而静止,部分出现不同程度身体弯曲,至(18.71±2.08)min时全部沉于水底静止不动(除了偶尔鳃盖骨的活动)。2.各组苏醒时间、中位生存时间及死亡率比较：模型组及牛磺酸组苏醒时间分别为(45.69±3.87)min和(22.39±1.55)min,差别有统计学差异(P均<0.05)。经后连续观察30d统计各组中位生存时间及死亡率,对照组、模型组及牛磺酸组三组的中位生存时间及死亡率分别为16d、6d、13d和57.36%、82.32%、70.26%,差别均有统计学意义(P均<0.05)。3.各组不同时间点脑组织细胞凋亡指数变化：荧光TUNEL染色结果显示,对照组脑组织凋亡指数极低；缺氧/复氧后1h脑组织细胞凋亡指数增加,模型组3h达高峰,随后逐渐下降,48h仍高于对照组;牛磺酸组同时间点低于模型组,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。4.各组不同时间点GRP78、GADD34 mRNA水平变化：RT-qPCR结果显示,与对照组相比,GRP78及GADD34 mRNA表达在缺氧/复氧后1h即上调,模型组1h达高峰,随后逐渐下降,其中GRP78mRNA表达在48h仍高于对照组(P<0.05),GADD34 mRNA表达在48h接近对照组水平；1h、3h、6h、24h时间点牛磺酸组表达低于模型组,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。5.各组不同时间点GRP78、GADD34蛋白水平变化：Western blot结果显示,对照组GRP78及GADD34蛋白表达量极低,GRP78及GADD34蛋白在缺氧/复氧后1h表达上调,模型组6h达高峰,随后逐渐下降,其中GRP78蛋白表达在48h时间点仍高于对照组,GADD34蛋白表达在48h时间点接近对照组水平；牛磺酸组亦低于模型组,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。6.相关分析：模型组幼鱼脑组织GRP78、GADD34蛋白表达变化均与凋亡指数呈显著正相关(r=0.53、0.56,P均<0.05)。结论1.本研究利用斑马鱼幼鱼缺氧/复氧性脑损伤模型,成功模拟了新生儿HIE病理发展过程。2.缺氧/复氧处理诱导斑马鱼幼鱼脑部ERS反应发生,同时神经细胞凋亡指数明显增加,说明缺氧/复氧性脑损伤幼鱼能通过上调GRP78、GADD34 mRNA及蛋白表达,启动细胞凋亡途径。3.牛磺酸处理缺氧/复氧性脑损伤斑马鱼幼鱼后,神经细胞凋亡指数减少,同时GRP78、GADD34 mRNA及蛋白表达下调,说明牛磺酸能通过抗ERS反应缓解斑马鱼幼鱼缺氧/复氧性脑损伤。