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水稻是世界上主要的粮食作物之一,全球约有一半以上的人口以水稻为主食,每年因稻瘟病损失的粮食产量足以养活至少6,000万人口。收集和鉴定稻瘟病抗性资源,挖掘水稻抗稻瘟病基因并加以应用具有重要的现实意义。Pi-hk1是实验室前期在粳稻地方品种黑壳子粳中定位到的一个具有广谱抗性的稻瘟病抗性位点,包含9个候选基因（P8-P16）,P15编码一个含有NBS-LRR结构域的蛋白,其互补表达转基因材料对稻瘟病的抗性显著增强;Pi-hk2是黑壳子粳中鉴定到的一个对稻瘟病菌表现小种专化型抗性的位点,位于9号染色体分子标记ID-9和RM24048间228 Kb区间内。本研究在此基础上进一步利用转基因技术对Pi-hk1位点的候选基因进行功能验证与分析,同时利用一个重组自交家系RIL84与感稻瘟病品种苏御糯回交产生的BC1F5和BC1F6两个群体对Pi-hk2位点进行精细定位,主要研究结果如下:1.Pi-hk1候选基因的转基因功能分析。构建了P15的CRISPR/Cas9突变体材料,发现P15的功能缺失突变会使黑壳子粳变得感病,说明P15可能在稻瘟病的抗病过程中发挥作用。抗病品种黑壳子粳中P15编码的蛋白比感病品种苏御糯中的P15蛋白多了两个WRKY结构域,利用P15蛋白全长、去掉一个WRKY结构域的P15蛋白和去掉两个WRKY结构域的P15蛋白分别与绿色荧光蛋白融合的基因载体分别转化感稻瘟病品种苏御糯,获得3类转基因植株。接种稻瘟病菌后,荧光显微观察结果表明,这3类融合蛋白都能在稻瘟病菌菌丝穿透细胞壁的附近区域聚集,说明他们能响应稻瘟病菌的侵染;抗性鉴定结果显示,转化P15蛋白全长的株系其对稻瘟病的抗性高于亲本苏御糯,WRKY结构域的缺失会影响P15介导的抗性。对P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P15、P16等抗病候选基因的互补转基因材料以及P15和P16两个抗病候选基因共转化（P12K）的互补转基因材料进行抗性鉴定,结果表明大部分的互补转基因材料的稻瘟病抗性水平与感病受体亲本苏御糯相比,没有显著提高;但在P9、P10、P11、P12、P13、P14和P15等候选基因的互补转基因材料有27个家系病斑长度比苏御糯下降或者病斑数目减少。推测Pi-hk1位点可能不是一个基因在发挥作用,需进一步研究这些候选基因是如何在抗稻瘟病过程中一起发挥作用的。2.Pi-hk2的精细定位与候选基因预测。以黑壳子粳与苏御糯杂交产生的一个抗病重组自交家系RIL84为亲本,从其与苏御糯回交产生的BC1F5（3,200个单株）和BC1F6（4,100个单株）群体中筛选出12株重组个体,开发了 D-M15、ID-M44、ID-M23、ID-M5、ID-M66以及CAP-1等6对分子标记。通过重组个体的基因型鉴定以及稻瘟病菌株2010-9（G1）的接种抗性鉴定,最终将Pi-hk2位点定位在分子标记ID-M5和RM24048之间110 Kb的区间内。候选基因预测表明,该区间包含LOC Os09g16440、LOC＿Os09g16449、LOC＿Os09g16458、LOC＿Os09g16470、LOC＿Os09g16480、LOC＿Os09g16490、LOC＿Os09g16500、LOC＿Os09g16510、LOC＿Os09g16520、LOC＿Os09g16530、LOC＿Os09g16540、LOC＿Os09g16550、LOC＿Os09g16560 等 13 个候选基因。其中 LOC＿Os09g16449、LOC＿Os09g16458、LOC＿Os09g16510、LOC＿Os09g16520、LOC＿Os09g16540、LOC＿Os09g16550 等 6 个候选基因编码有被注释功能的蛋白,LOC＿Os09g16440、LOC＿Os09g16480、LOC＿Os09g16490、LOC＿Os09g16530等4个候选基因编码转座子相关蛋白,LOC Os09g16470和LOC＿Os09g16560编码假定蛋白,LOC Os09g165001编码未知蛋白。研究结果为进一步克隆Pi-hk2基因奠定基础。