马铃薯StLOR基因家族鉴定和StLOR7基因功能研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wzgl2005
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寄生霜霉菌响应迟发上调基因(Late up-regulated in response to Hyaloperonospora pa rasitica,LURP1)属于LOR基因家族,在植物抵御卵菌属(Oomycetes)病原菌的反应和抗逆中起到关键作用。目前,对LURP1基因功能的研究仍不完善,且多局限于模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,其在马铃薯(Solanum tuberosum L.)中的研究尚未见报道。此外,迄今还没有在任何物种中进行LOR基因家族系统鉴定的报道。本实验室的前期实验中发现一个功能未知、但能与脱水响应元件(Dehydration responsive element,DRE)相互作用的基因,经本地序列基本搜索工具(Basic loocal alignment search tool,BLAST)比对,该基因为马铃薯StLURP1。本研究通过生物信息学手段在基因组水平上鉴定了马铃薯StLOR基因家族,同时重点关注与DRE元件相互作用的基因StLOR7。为了阐明马铃薯StLOR7基因的生物学功能、明确其在蛋白互作网络中的作用和其亚细胞定位情况,本研究构建了过表达载体pBI121-StLOR7,并转化马铃薯四倍体栽培品种“大西洋”;利用同源重组的定向克隆方式构建了酵母(Saccharomyces cerevisiae)双杂交系统(Yeast two-hybrid system)诱饵载体pGBKT7-StLOR7,并筛选马铃薯cDNA文库。取得的主要结果如下:1.鉴定出马铃薯StLOR基因家族中16个含有完整开放阅读框和LOR结构域的成员,根据它们的染色体分布将其重新命名为StLOR1-16;明确了StLORs的理化性质、基因结构、蛋白基序、在种内及种间的系统发育情况;在StLORs的上游启动子区发现了多种与胁迫和激素相关的顺式作用元件,暗示该家族能够广泛地响应胁迫和植物激素处理;进行了基于公共转录组数据的StLOR基因家族在马铃薯不同组织中的分布情况和在不同胁迫及激素处理下的表达模式分析,发现StLOR基因家族成员在马铃薯不同组织中的分布具有特异性;此外,两个StLOR成员能响应热胁迫(3、9);三个成员能响应GA3处理(1、2、12);StLOR11、12和StLOR1、2能够分别响应BAP和ABA处理;BABA处理时,StLOR14、15的表达量显著升高,同时StLOR4、8、16下调;StLOR5专一地响应机械损伤。但StLORs的表达似乎不能被盐和渗透胁迫诱导。2.通过实时定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检验了StLOR基因家族16个成员在4种胁迫(渗透、干旱、冷、热胁迫)及4种及激素(赤霉素、脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯)处理下的表达模式。其中除StLOR13、14外,其余家族成员都能响应盐胁迫处理;StLOR2和StLOR13专一性地分别受盐胁迫和冷胁迫诱导;StLOR4、StLOR6和StLOR7受脱落酸的诱导;StLOR1、3、5、15、16能响应多种不同激素处理;StLOR8受热胁迫诱导。本研究同时考察了StLOR7的相对表达量在上述8种处理下随时间变化的趋势,发现StLOR7仅能微弱地响应热胁迫、干旱胁迫和水杨酸处理,但其受到GA3、MeJA和盐胁迫的强烈诱导,其表达量在24 h时极显著上调,在48 h处达到最大值。3.构建了由CaMV 35S启动子驱动的过表达载体pBI121-StLOR7,并通过薯片转化法转化马铃薯四倍体栽培品种“大西洋”。经过新霉素磷酸转移酶基因NPT II的PCR检验和qRT-PCR检验,StLOR7已成功插入转基因植株的基因组中。4.本研究克隆了StLOR7基因的CDS区,并通过同源重组的定向克隆方式构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-StLOR7。利用酵母的接合生殖使诱饵蛋白与cDNA文库杂交并涂布高严谨筛选培养基,筛选得到126个候选阳性克隆,其中有88个单克隆能在染色筛选中水解显色底物X-α-Gal,阳性率接近70%。经测序得到含正确开放阅读框的StLOR7互作蛋白12种,包括DnaJ家族蛋白、甘油磷酸二酯酶、多酚氧化酶、富脯氨酸蛋白、肌动蛋白解聚因子、重金属转运蛋白等。互作蛋白的基因本体论(Gene Ontology,GO)注释分析暗示StLOR7可能参与植物病原防御、胁迫响应、重金属解毒、微丝运动、脂类代谢、蛋白质折叠与磷酸化等重要生物过程。初步明确了StLOR7蛋白的互作网络关系。
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