龙眼是重要的热带南亚热带风光代表性的风景树，龙眼古树是热带南亚热带地区城市园林绿化和风景区的重要组成部分之一；龙眼古树在园林景观中往往是一道无与伦比的风景线，是一个城市重要的自然和人文景观；龙眼古树的基因图谱往往有其特殊性，蕴含有抗性基因以及其他有价值的基因，是植物遗传改良的宝贵种质资源。本试验以福建省福州市、莆田市、泉州市等地的29份龙眼古树种质资源为材料，利用ISSR分子标记技术进行遗传多样性分析，初步确定了这些龙眼古树核心种质资源；对核心种质资源进行限制生长保存；从龙眼古树胚性愈伤组织中克隆WRKY家族基因，并采用qPCR技术分析了龙眼古树胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC） WRKY家族基因在低温胁迫下的表达模式，为龙眼古树的保护与开发利用提供科学依据。主要的研究结果如下：1龙眼古树遗传多样性的ISSR分析本试验利用ISSR分子标记技术对29份龙眼古树进行了分析，通过引物筛选共筛选出9条多态性好、条带清晰且重复性好的ISSR引物，利用这9条引物对29份龙眼古树进行ISSR扩增，获得了这29份龙眼古树基因组DNA的ISSR-PCR扩增图谱。扩增结果表明：从随机引物中筛选出9条随机引物对29份龙眼古树资源PCR扩增条带在6-12条之间，共扩增出84条条带,其中多态性条带72条，多态性比例为85.71%。当遗传相似系数(GS)为0.82时，将这29份材料可以为8类（第一类主要包括‘鹅峰村1号’和‘鹅峰村2号’；第二类主要包括‘鹅峰村3号’、‘鹅峰村4号’、‘鹅峰村5号’、‘鹅峰村6号’、‘鹅峰村7号’、‘鹅峰村8号’、‘鹅峰村9号’、‘鹅峰村10号’、‘鹅峰村13号’、‘鹅峰村14号’、‘鹅峰村15号’、‘鹅峰村19号’、‘鹅峰村20号’、‘鹅峰村21号’；第三类主要包括：‘鹅峰村22号’、‘洪塘里洪光村1号’、‘洪塘里洪光村2号’、‘洪塘里洪光村3号’、‘福州森林公园1号’和‘福州森林公园2号’；第四类主要包括：‘鹅峰村16号’、‘鹅峰村17号’；第五类:‘福州西湖公园1号’；第六类：‘莆田1号’；第七类：‘泉州1号’、‘泉州2号’；第八类：‘莆田2号’），这29份龙眼古树材料中，同一地区的龙眼古树资源基本分在同一组，说明龙眼古树的亲缘关系基本上与地理分布相符合；但是，有个别龙眼古树资源的分布与地区分布不相符，这说明不同地理区域的龙眼古树资源有人为或自然引起的基因交流。根据龙眼古树ISSR条带的代表性，结合考虑树龄、知名度等因素，初步确定‘鹅峰村1号’、‘鹅峰村21号’、‘福州森林公园1号’、‘鹅峰村17号’、‘福州西湖公园1号’、‘莆田1号’、‘莆田2号’、‘泉州1号’等8份龙眼古树为核心种质，为今后龙眼古树种质资源的保护和利用提供参考依据。2龙眼古树种质资源的离体限制生长保存通过幼胚诱导得到了8份龙眼古树核心种质的胚性愈伤组织，并以莆田宝庵寺的‘宝树’(PT1)为主试材料，研究了不同浓度的B9对龙眼古树EC离体保存过程中的影响，研究结果表明：当在培养基中添加10mg/L的B9，龙眼古树的继代时间可以延长到45d。还研究了不同浓度高渗化合物对龙眼古树EC离体保存过程中的影响，将材料接种于MS+1.0mg/L2,4-D+6g/L琼脂+5mg/L肌醇+20g/L甘露醇+30g/L蔗糖的培养基中，继代时间可以延长到105d。将8份龙眼古树核心种质愈伤组织接种于最佳离体保存培养基中（MS+1.0mg/L2,4-D+6g/L琼脂+5mg/L肌醇+20g/L甘露醇+30g/L蔗糖）进行限制生长保存研究。结果表明：大部分龙眼古树EC可以保存95d左右，莆田‘宝树’可以保存105d，‘福州森林公园1号’和‘鹅峰村21号’保存时间最短，约80d。3龙眼古树EC WRKY家族基因的克隆与生物信息学分析对龙眼古树EC WRKY家族基因进行同源克隆，得到了DlWRKY B、DlWRKY2-4、DlWRKY2-5、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44、DlWRKY47-2、DlWRKY72-3共10条cDNA全长序列（登陆检索号分别为JF709002、JF708994、JF709001、JF709010、JF708963、JF708965、JF709012、JF709004、JF708966），并对克隆得到的序列进行生物信息学分析。结果表明: DlWRKY B、DlWRKY2-4、DlWRKY2-5、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44、DlWRKY47-2、DlWRKY72-3这10个蛋白都是不稳定、亲水蛋白、不具有信号肽，这10个蛋白均不是分泌蛋白，均具有丰富的磷酸化位点，这可能是该基因发挥功能所必需的。DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY31、DlWRKY44亚细胞定位于细胞核中的可能性最大， DlWRKY2-5、 DlWRKY47-2、DlWRKY72-3亚细胞定位于细胞质中的可能性最大，细胞质是进行新陈代谢的主要场所，DlWRKY2-5、 DlWRKY47-2、DlWRKY72-3可能参与到新陈代谢的过程中。DlWRKY B、DlWRKY2-5、DlWRKY17这3个蛋白不仅没有螺旋卷曲结构，还不具有跨膜结构。DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY31、DlWRKY44、DlWRKY47-2、DlWRKY72-3这5个蛋白均存在一个或多个跨膜结构且均具有螺旋卷曲结构。蛋白质保守结构域预测结果表明：DlWRKY2-4、DlWRKY17、DlWRKY44这3个蛋白均含有2个WRKY结构域；DlWRKYB、DlWRKY2-5、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY31、DlWRKY47-2、DlWRKY72-3含有一个WRKY保守结构域，这与这10个蛋白结构分析结果一致。4低温胁迫条件下龙眼古树EC WRKY家族基因的qPCR表达分析本试验还研究了DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44在不同低温处理、同一低温不同低温持续时间、龙眼古树资源和普通栽培品种间的低温胁迫处理龙眼古树EC WRKY家族基因的表达情况。①不同温度处理龙眼古树EC WRKY家族基因的qPCR定量表达不同低温处理条件下，不同WRKY基因家族成员表达量的变化趋势不一致，随着温度的降低DlWRKY2-4的表达量逐渐升高，当温度降到15℃是表达量达到最高，之后随着温度的降低，DlWRKY2-4的表达量逐渐降低；DlWRKY5随着温度的降低，表达量也逐渐降低，当温度降到15℃时表达量达到最低，之后随着温度的继续降低表达量逐渐升高；DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44这4个基因的表达变化趋势一致，都是随着温度的降低表达量逐渐升高，温度由15℃降到10℃的过程中，这4个基因的表达迅速降低，和对照组的表达量相接近，10℃后，温度逐渐降低，这4个基因的表达量逐渐升高。②不同低温持续时间龙眼古树EC WRKY家族基因的qPCR表达同一低温不同低温持续时间处理条件下，DlWRKY2-4、DlWRKY6-1、DlWRKY44这3个基因的变化趋势一致，都是随着低温持续时间的延长，表达量逐渐升高，DlWRKY2-4、DlWRKY6-1、DlWRKY17这3个基因在低温持续处理24h时，表达量达到最高，DlWRKY44在低温处理48h时表达量达到最高，之后随着低温持续时间的加长，表达量逐渐降低。DlWRKY5、DlWRKY31变化趋势为先升高后降低，之后在升高后又降低。③不同古树与栽培品种之间EC WRKY家族基因qPCR表达在同一低温、相同的低温持续时间条件下， DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY17、DlWRKY44在不同材料之间均有表达，这说明DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44表达受低温胁迫的诱导，但这几个基因的表达量有很大的差异，可能是同一基因在同一植物不同基因型植物中得作用不相同。DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44在不同材料中的表达不一致，且变化剧烈，DlWRKY6-1、DlWRKY31在龙眼古树叶片中几乎不表达，这说明他们表达还有组织特异性。总之，DlWRKY2-4、DlWRKY5、DlWRKY6-1、DlWRKY17、DlWRKY31、DlWRKY44这6个基因受到低温胁迫的诱导表达，这6个基因在不同低温处理以及不同低温持续时间诱导时表达模式存在着较大的差异，表达模式的差异是基因生物学功能不相同的体现形式，这些差异可能是在不同的抗逆境信号转导途径中发挥的生物学功能不同，还说明WRKY基因的具有多样且复杂的调控体系。龙眼古树的栽培品种WRKY基因的表达与古树的表达模式存在差异， DlWRKY5在龙眼古树中的表达量高于栽培品种，这可能是由于龙眼古树获得了一系列的应答保护机制；还可能是由于不同材料的生长状况不一致；还可能是由于长期的自然选择和人为选择所导致的，古树具有能够适应环境剧烈变化的遗传基础，因而导致他们之间的表达模式不相同。