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优质种子是中药材规范化种植的基础，也是药材质量形成的源头保障。中药材质量形成研究中常借助现代生物技术手段，而中药材基原物种又各不相同，需针对不同品种构建组织培养体系，以适应中药现代化研究。中药大黄在生产源头上存在种子质量不齐、研究中缺乏高效稳定的组培体系，极大的限制了高品质大黄的生产实际及现代研究。开展大黄种子质量特性及高效组培体系研究，将为大黄优良种质快繁、细胞培养及次生代谢调控研究提供科学基础。
本研究收集不同来源的掌叶大黄RheumpalmatumL.种子，对其外观形状、净度、含水量、生活力、千粒重、发芽率和发芽势等指标进行分析；正交实验设计筛选掌叶大黄无菌苗培养的最佳消毒方式及愈伤组织诱导的最佳培养条件，进而设计生芽生根实验，建立再生苗培育的适宜体系，并考察掌叶大黄毛状根诱导过程中的影响因素，优化最适培养条件；利用高效液相色谱法对获得的无菌苗、愈伤组织、再生苗和毛状根等无菌材料进行10种活性成分含量测定。主要研究内容及结果如下：
1.对收集的15批掌叶大黄种子的外观形态观察及长宽数据统计分析无显著差异，而其发芽特性指标数据净度、千粒重、含水量、生活力、发芽率和发芽势各批次间存在显著差异，利用SPSS24.0对发芽特性数据进行K-均值聚类分析，表明15批掌叶大黄种子可被分成三个等级，其中ZYDH3、ZYDH7、ZYDH12与ZYDH13掌叶大黄种子为一级种子，其发芽率较高分别为71.0%、71.0%、81.7%和83.3%。最终获得了掌大黄的优质种子。
2.将掌叶大黄优质种子预先用无菌水浸泡24h，撕去果翅，设计3因素3水平正交实验考察不同因素水平对掌叶大黄发芽成无菌苗的影响，优化出大黄无菌苗培养最适条件为75%乙醇预处理30s、10%H2O2消毒15min，可获得健康无菌苗；在此基础上设计正交实验，优化出愈伤组织培养适宜激素配比为6-BA(1.0mg/L)+KT(2.0mg/L)+NAA(1.5mg/L)，子叶、叶片、叶柄在此条件下均可诱导出结构致密、浅黄绿色的愈伤组织，生芽激素配比宜采用6-BA(2.0mg/L)+IBA(1.0mg/L)，生根培养基为1/2MS+NAA(0.5 mg/L)，致此可获得再生苗。
3.对掌叶大黄毛状根转化过程中的菌株类型、外植体类型、菌液浓度、预培养时间、侵染时间和共培养时间等影响因素进行考察，最终优化出掌叶大黄毛状根适宜的诱导条件为：农杆菌LBA9402，该菌液浓度吸光值达到0.4-0.6时，侵染预培养2-3d掌叶大黄叶片20min，两者共培养3d，此条件下毛状根诱导率可达70.0%-80.0%，并对获得的掌叶大黄毛状根进行PCR验证反应和扩大培养，获得生长迅速的毛状根，为掌叶大黄其蒽醌类合成途径研究及大规模生产蒽醌类活性成分提供科学依据。
4.采用前期建立的高效液相色谱法对掌叶大黄无菌苗、愈伤组织、再生苗和毛状根进行成分含量检测，四种无菌材料中10种蒽醌类成分含量存在显著差异。无菌苗里番泻苷B含量最高为1.130mg/g，再生苗里则是大黄酚-8-O-葡萄糖苷含量最高为0.849mg/g；而愈伤组织和毛状根不能完全检测出10种成分，愈伤组织可检测到7种成分，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷含量最高为0.294mg/g；毛状根中可检测到6种成分，以大黄素含量最高为0.061mg/g，最终表明不同无菌材料体内次生代谢产物积累的活跃程度不同。
本研究收集不同来源的掌叶大黄RheumpalmatumL.种子，对其外观形状、净度、含水量、生活力、千粒重、发芽率和发芽势等指标进行分析；正交实验设计筛选掌叶大黄无菌苗培养的最佳消毒方式及愈伤组织诱导的最佳培养条件，进而设计生芽生根实验，建立再生苗培育的适宜体系，并考察掌叶大黄毛状根诱导过程中的影响因素，优化最适培养条件；利用高效液相色谱法对获得的无菌苗、愈伤组织、再生苗和毛状根等无菌材料进行10种活性成分含量测定。主要研究内容及结果如下：
1.对收集的15批掌叶大黄种子的外观形态观察及长宽数据统计分析无显著差异，而其发芽特性指标数据净度、千粒重、含水量、生活力、发芽率和发芽势各批次间存在显著差异，利用SPSS24.0对发芽特性数据进行K-均值聚类分析，表明15批掌叶大黄种子可被分成三个等级，其中ZYDH3、ZYDH7、ZYDH12与ZYDH13掌叶大黄种子为一级种子，其发芽率较高分别为71.0%、71.0%、81.7%和83.3%。最终获得了掌大黄的优质种子。
2.将掌叶大黄优质种子预先用无菌水浸泡24h，撕去果翅，设计3因素3水平正交实验考察不同因素水平对掌叶大黄发芽成无菌苗的影响，优化出大黄无菌苗培养最适条件为75%乙醇预处理30s、10%H2O2消毒15min，可获得健康无菌苗；在此基础上设计正交实验，优化出愈伤组织培养适宜激素配比为6-BA(1.0mg/L)+KT(2.0mg/L)+NAA(1.5mg/L)，子叶、叶片、叶柄在此条件下均可诱导出结构致密、浅黄绿色的愈伤组织，生芽激素配比宜采用6-BA(2.0mg/L)+IBA(1.0mg/L)，生根培养基为1/2MS+NAA(0.5 mg/L)，致此可获得再生苗。
3.对掌叶大黄毛状根转化过程中的菌株类型、外植体类型、菌液浓度、预培养时间、侵染时间和共培养时间等影响因素进行考察，最终优化出掌叶大黄毛状根适宜的诱导条件为：农杆菌LBA9402，该菌液浓度吸光值达到0.4-0.6时，侵染预培养2-3d掌叶大黄叶片20min，两者共培养3d，此条件下毛状根诱导率可达70.0%-80.0%，并对获得的掌叶大黄毛状根进行PCR验证反应和扩大培养，获得生长迅速的毛状根，为掌叶大黄其蒽醌类合成途径研究及大规模生产蒽醌类活性成分提供科学依据。
4.采用前期建立的高效液相色谱法对掌叶大黄无菌苗、愈伤组织、再生苗和毛状根进行成分含量检测，四种无菌材料中10种蒽醌类成分含量存在显著差异。无菌苗里番泻苷B含量最高为1.130mg/g，再生苗里则是大黄酚-8-O-葡萄糖苷含量最高为0.849mg/g；而愈伤组织和毛状根不能完全检测出10种成分，愈伤组织可检测到7种成分，以大黄酚-8-O-葡萄糖苷含量最高为0.294mg/g；毛状根中可检测到6种成分，以大黄素含量最高为0.061mg/g，最终表明不同无菌材料体内次生代谢产物积累的活跃程度不同。