论文部分内容阅读
近年来,金属纳米簇作为一种新兴的纳米材料得到了广泛的研究及应用。与有机荧光染料等传统荧光探针相比,金属纳米簇显示出更优越的荧光特性,如良好的生物相容性、较强的光稳定性以及较高的荧光量子产率等,在荧光传感和生物成像领域显现出广阔的应用前景。本文围绕DNA模板化的铜纳米簇在生物传感领域的应用,主要开展了以下工作:首先,本论文设计了一种哑铃型双链DNA探针作为合成铜纳米簇的模板,同时利用E.Coli DNA连接酶对辅酶Ⅰ的高度依赖性,并结合Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用,发展了一种免标检测辅酶Ⅰ的荧光分析新方法。哑铃型探针通过Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸作用可以产生更长的双链DNA铜簇模板,从而使体系荧光信号大大增强。当E.Coli DNA连接酶被辅酶Ⅰ激活后,哑铃型DNA探针相邻的5’端磷酸基团和3’端羟基被连接起来形成一个封闭的“哑铃”结构,体系荧光信号无法得到增强。这个方法比较灵敏,检测限达到了0.2 nM,并且在复杂的生物体系中也实现了对辅酶Ⅰ活性的分析。接下来,本论文基于富T碱基单链DNA模板化的铜纳米簇和T4多聚核苷酸激酶的3’端去磷酸化活性,结合Klenow Fragment聚合酶的延伸作用,提出了一种免标分析T4多聚核苷酸激酶及其抑制剂活性的荧光方法。由于T4多聚核苷酸激酶能够催化DNA的3’端发生去磷酸化反应,所以探针3’端的磷酸基团被水解为羟基,再通过Klenow Fragment聚合酶的聚合延伸反应生成与富T碱基互补的双链DNA结构,致使富T碱基序列由于双链化而不能作为模板合成铜纳米簇。当不存在T4多聚核苷酸激酶时,3’端磷酸化修饰的探针无法发生聚合延伸反应产生双链结构,可利用富T碱基DNA单链合成铜纳米簇,体系产生较强的荧光信号。这种方法选择性很高,检测限达到了0.25 U/mL,同时还能实现复杂生物环境中T4多聚核苷酸激酶活性的分析检测。最后,本论文基于富T碱基环状DNA探针为模板合成的铜纳米簇设计了一种简单、灵敏、成本低、免标检测核酸外切酶Ⅲ活性的新方法。发夹探针的环状部分由T碱基序列构成,可以作为模板制备荧光铜纳米簇。当存在核酸外切酶Ⅲ时,探针平齐的3’端双链部分会被水解为DNA片段,从而环状序列被打开呈线型直链结构,体系荧光信号大大减弱。与已报道的方法相比,本方法不需要复杂的探针设计、成本较高的荧光染料标记和繁复的实验仪器,在生命活动和医学诊断等领域的研究都具有很高的应用前景。