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角膜内皮细胞(CECs)是位于角膜最里层的单层分化细胞。CECs借助其泵功能和屏障功能,使角膜基质处于相对脱水状态来维持角膜的透明性。然而CECs的再生能力十分有限,成年后的CECs有丝分裂停滞于G1期,眼科疾病、炎症、外伤、手术及年龄增长均导致CECs密度降低,重者出现角膜的不可逆性水肿甚至角膜内皮盲。因此探讨CECs的增殖能力与增殖机制是当今角膜移植领域的研究热点,临床上也迫切需要寻找一些促进CECs增殖的新药物、新方法。缓激肽(BK),属于激肽释放酶-激肽系统的一员,参与了机体众多的生物学过程,并在炎症、疼痛、血管生成、细胞增殖、肿瘤发生、血脑屏障通透性调节等病理生理过程中起重要作用。在角膜组织,有学者先后证实B1受体与B2受体的存在,BK促进角膜上皮细胞、成纤维母细胞、角膜基质细胞及CECs在内的多种角膜细胞的增殖,其机制可能与B2受体有关。ZO-1相关性核酸结合蛋白(ZONAB)是一种Y-box转录抑制因子,通过结合于闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的SH3结构域,并与多种调控细胞周期的基因、蛋白、酶、转录因子等相互作用,共同构成ZO-1/ZONAB信号通路,参与细胞增殖、细胞分化、基因表达及形态发生等过程的调控。目前相关研究主要涉及肾小管、视网膜、角膜、肺泡上皮、神经胶质细胞及肿瘤等组织细胞。研究发现,慢病毒转染干扰ZO-1诱导ZO-1的低表达促进人角膜上皮细胞的密度增加和体外增殖;在II型肺泡上皮细胞,ZONAB高表达显著促进细胞增殖并抑制其转分化,而ZONAB低表达时细胞增殖减少,转分化增多。那么,缓激肽促进CECs增殖的作用是否与ZO-1/ZONAB信号通路有关,目前未见报道。本实验即是在前期家兔角膜内皮细胞(RCECs)体外培养模型的基础上,探讨缓激肽对RCECs增殖的影响及ZO-1/ZONAB信号通路在其中的作用,以期为角膜再生提供新的思路。研究内容:1.不同浓度BK对RCECs增殖的影响:采用揭膜法结合胶原酶消化法获取纯净的RCECs原代细胞,待细胞80%~90%贴壁融合后进行传代培养。设置不同浓度的BK处理组(0.01、0.1、1、10μM)与正常细胞对照组,离体培养RCECs并观察不同时间点(24 h、48 h、72 h、96 h)各组细胞的形态学变化;MTT检测各组在各时间点的细胞增殖情况;Western Blot检测72 h各组核内ZONAB蛋白与紧密连接处ZO-1蛋白的表达状况,同时以免疫荧光法检测ZONAB的表达。2.ZONAB-siRNA的细胞转染及有效靶点筛选:采用脂质体转染的方法,将人工体外合成的转染特异性ZONAB-siRNA片段(1195、1051与685)、转染非特异性siRNA阴性对照片段(siRNA-NC)导入RCECs。利用real-time PCR验证各组ZONAB mRNA的表达,Western Blot验证各组ZONAB蛋白的表达。根据沉默效果筛选出抑制作用最强的靶序列。3.ZONAB-siRNA转染联合缓激肽处理对RCEC_S增殖的影响:取对数生长期的细胞,分别设置空白对照组(Control组)、1μM的BK处理组(BK组)、NC-siRNA与ZONAB-siRNA的转染组(NC-siRNA组、ZONAB-siRNA组)、siRNA转染+BK组(NC-siRNA+BK组、ZONAB-siRNA+BK组)。体外培养72 h后,利用MMT法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测RCECs的细胞周期状况,Western Blot检测ZO-1、ZONAB、PCNA与cyclin D1蛋白的表达。结果:1.不同浓度BK对RCECs增殖的影响:1)0.01~1μM的BK处理后,72 h细胞贴壁并融合成片,细胞紧密连成单层;10μM时细胞生长开始受限,细胞间隙变大,随时间延长生长明显受限,脱落细胞增多。2)MTT结果显示72 h内细胞活性随BK浓度增加而呈不断增强,以1μM的BK促增殖作用最为显著,而10μM的BK则表现为一定程度的增殖受限。3)免疫荧光结果显示0.01μM~1μM缓激肽组与control组相比,随BK浓度升高,ZONAB阳性细胞比例逐渐增多;将缓激肽增加至10μM,ZONAB阳性细胞比例反而减少。4)Western Blot结果显示0.01μM~10μM的BK浓度依赖性地促进紧密连接处ZO-1蛋白的表达;0.01μM~1μM的BK处理,核内ZONAB蛋白表达量随BK浓度升高而增加,以1μM的BK促ZONAB核内转位的作用最强,而10μM的BK处理后ZONAB核内转位反而受抑制。2.ZONAB-siRNA的细胞转染及有效靶点筛选:real-time PCR结果表明ZONAB-siRNA转染后,ZONAB mRNA表达水平显著下调;Western Blot结果表明RCECs核内ZONAB蛋白表达也显著下调。且均以1051组下降最为明显,ZONAB-1051序列为最佳的靶序列。3.ZONAB-siRNA转染联合缓激肽处理对RCEC_S增殖的影响:1)缓激肽明显促进RCECs增殖活性和有丝分裂过程,上调ZO-1、ZONAB、PCNA与cyclin D1蛋白的表达;2)ZONAB-siRNA转染后,ZO-1、ZONAB、PCNA与cyclin D1的表达减少,细胞增殖减少、有丝分裂受抑制;3)在缓激肽处理前,预先行ZONAB-siRNA转染,则能完全逆转缓激肽的上述促增殖效应。结论:1.中低浓度(0.01~1μM)的BK呈浓度依赖性地促进RCECs增殖,而高浓度(10μM)则表现为一定程度的增殖受限,且以1μM BK促细胞增殖作用最为显著,提示我们在体外培养基中加入缓激肽或其类似物,具有促进CECs增殖的功效。2.缓激肽促进紧密连接处ZO-1蛋白的表达及ZONAB的核内转位,提示ZO-1/ZONAB信号通路可能是BK促进RCECs增殖的主要机制之一。3.转染ZONAB-siRNA后,细胞核内ZONAB蛋白与mRNA表达均明显减少,故RNAi成功地实现了对ZONAB的转录后基因沉默。4.转染ZONAB-siRNA后,ZO-1与ZONAB的表达明显减少,细胞增殖指标PCNA及cyclin D1表达明显减少,细胞增殖水平降低。5.ZONAB-siRNA转染显著逆转缓激肽对RCECs的增殖促进作用,提示ZO-1/ZONAB信号通路在缓激肽诱导的CECs增殖过程中起着重要的作用。靶向干预ZO-1/ZONAB信号通路,有可能为角膜再生与角膜移植提供新的思路与药物治疗靶点。