严重创伤/休克失代偿期常出现血管低反应性(hyporesponsiveness),主要表现为全身血管对缩血管和舒血管物质的反应减弱或不反应,它参与了创伤/休克的发生发展,制约着创伤/休克的治疗[1-3]。目前的研究发现,血管低反应性的发生可能与一氧化氮(nitric oxide,NO)水平增高、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的K+、Ca2+通道功能失常及细胞膜超极化、VSMC的钙敏感性降低有关,但抑制NO、恢复K+、Ca2+通道功能、恢复细胞膜极化状态和钙敏感性并不能完全逆转血管低反应性[4-8]。血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)是覆盖于血管腔面的单层鳞状上皮细胞,它除了具有屏障作用和调节血管内外物质交换的作用以外,还是一种活跃的代谢及内分泌器官,它可以分泌、合成和降解多种活性物质,实现其调节血管张力、细胞间黏附、血管生长以及抗凝和促凝的作用。缝隙连接(gap junction,GJ)是存在于相邻细胞间的一种膜通道结构,它允许电信号和分子质量低于1000Da或直径小于1.0nm的离子或小分子物质通过,如:小分子代谢产物、水分子、第二信使(Ca2+、三磷酸肌醇、环核苷酸)等。GJ的基本组成单位是连接蛋白(connexin,Cx),在人类基因谱中连接蛋白有21个成员,分别以其分子量命名,例如:Cx43,代表了分子量为43kDa的连接蛋白;在血管系统中以表达Cx37、Cx40和Cx43为主[9]。目前发现,GJ的功能缺陷或异常与高血压、动脉粥样硬化等多种心血管疾病有关。VEC和VSMC间的GJ被命名为肌内皮缝隙连接(myo-endothelial gap junction,MEGJ),MEGJ可以穿过血管内弹力层,使VEC能够与VSMC进行直接的电和化学交流[9、10],从而参与血管紧张性调节[9]。但MEGJ是否参与了休克后血管低反应性的调节,国内外尚未见报道。为此,本实验利用SD大鼠失血性休克模型,分别从血管环水平和细胞水平研究了Cx37、Cx40和Cx43对休克后血管收缩反应和舒张反应的调节作用及其可能机制。具体内容包括:(1) MEGJ对休克后血管反应性的调节作用;(2)不同类型的缝隙连接蛋白与休克后血管反应性变化的关系;(3) MEGJ调节休克后内膜依赖性血管收缩反应的可能机制;(4) MEGJ调节休克后内膜依赖性血管舒张反应的可能机制。主要实验方法:第一部分,MEGJ对休克后血管反应性的调节作用;实验以失血性休克SD大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)为研究对象,观察18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetic acid,18α-GA)处理后,休克大鼠SMA (休克即刻,休克30min,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h)对非内膜依赖的血管收缩剂去甲肾上腺素(norepinephrine,NE)和舒张剂硝普钠(sodium nitroprusside,SNP),以及内膜依赖的血管收缩剂杨梅黄酮(Myricetin)和舒张剂乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)的反应性变化,分析休克后内膜依赖和非依赖的血管舒缩反应性变化与MEGJ的关系。第二部分,不同类型的缝隙连接蛋白与休克后血管反应性变化的关系;实验取休克大鼠不同时相点(休克即刻,休克30min,休克1h,休克2h,休克3h,休克4h) SMA,运用RT-PCR检测Cx37、Cx40、Cx43的mRNA表达变化;运用Western blotting检测Cx37、Cx40、Cx43的蛋白表达变化;运用Cx40和Cx43的反义寡脱氧核苷酸转染SMA阻断Cx40或Cx43的表达,检测血管环的反应性变化,以明确参与休克后血管反应性调节的连接蛋白类型。第三部分,MEGJ调节休克后血管内膜依赖性收缩反应的可能机制;以Cx40或Cx43的反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AODN)阻断SMA或VSMC的Cx40或Cx43表达,观察在Myricetin作用下,不同程度缺氧的SMA在钙敏感性、MLCP活性、MLC20磷酸化状态和MLCK活性等方面的变化,以及不同程度缺氧的VSMC胞内钙离子浓度(intracellular Ca2+ concentration,[Ca2+]i)的变化,探索MEGJ调节休克后内膜依赖的血管收缩反应性的可能机制。第四部分,MEGJ调节休克后血管内膜依赖性舒张反应的可能机制;以Cx40 AODN和Cx43 AODN阻断SMA或VSMC的Cx40或Cx43表达,观察在Ach作用下不同程度缺氧的SMA在钙敏感性、MLCP和MLCK活性等方面的变化,以及不同程度缺氧的VSMC [Ca2+]i的变化,探索MEGJ调节休克后内膜依赖的血管舒张反应性的可能机制。主要研究结果:1、MEGJ对休克后血管反应性的调节作用18α-GA对正常血管环和休克血管环对非内膜依赖的血管舒张剂(SNP)和收缩剂(NE)的舒/缩反应性没有明显影响。对于内膜依赖性的收缩剂——Myricetin,正常对照组、休克0h、0.5h、1h和2h组大鼠SMA的反应性渐进性增加,最大收缩反应在休克2h,休克3h和4h的血管环收缩反应性明显下降;18α-GA作用后,各组血管环的收缩反应均明显下降,其中,休克0h和0.5h组对Myricetin的收缩反应性仍然高于18α-GA作用后的正常对照组,休克1h、2h、3h和4h组的血管收缩力趋于一致,明显弱于18α-GA作用后的正常对照组。实验结果说明MEGJ在失血性休克大鼠内膜依赖性的血管收缩反应变化中具有重要的调节作用。对于内膜依赖性的舒张剂——Ach,休克组血管环的舒张反应较正常对照组明显下降;在休克组中,休克0h组对10-9、10-8、10-7 mol/L Ach的舒张反应与0.5h、1h和4h组一致,明显低于2h和3h组,对10-6、10-5 mol/L Ach的舒张反应明显高于0.5h、1h和4h组,低于2h和3h组;休克2h和3h组的舒张反应明显高于休克0.5h、1h和4h组;18α-GA可以使正常组和休克组血管环对不同浓度Ach(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的舒张反应降低;加18α-GA处理后的不同程度休克组的舒张反应无明显差异。休克血管环对Ach的最大舒张反应以休克0.5h组为最低,休克1h和2h组较休克0.5h组有所增加,2h后又继续下降;18α-GA可以使这种先下降—后增加—再下降的趋势消失,即:使各休克组对Ach的反应性趋于一致。实验结果说明MEGJ在失血性休克大鼠内膜依赖性的血管舒张反应变化中也具有重要的调节作用。2、不同类型的缝隙连接蛋白与休克后血管反应性变化的关系在RT-PCR和Western blotting实验中发现,Cx37和Cx40在休克后0h、0.5h、1h、2h逐渐表达下降,到休克后2h达最低点,休克后3h、4h表达逐渐升高;Cx43在休克后0h表达迅速降低,从0h开始表达逐渐升高,到休克后2h达最高点,休克后3h、4h表达逐渐降低;运用Cx40AODN阻断Cx40的表达后,正常组、缺氧1h组和缺氧3h组血管环内膜依赖性的收缩/舒张反应较相应的未加Cx40AODN的对照组血管环明显升高;运用Cx43AODN阻断Cx43的表达后,正常组、缺氧1h组和缺氧3h组血管环的收缩/舒张反应较相应的未加Cx43AODN的对照组血管环的反应性明显下降。实验结果说明Cx40与休克血管反应性的变化呈负相关关系,具有抑制休克后内膜依赖性的血管舒张反应和收缩反应的作用;Cx43与休克后血管反应性的变化呈正相关关系,具有促进休克后内膜依赖性的血管舒张反应和收缩反应的作用。3、MEGJ调节休克后血管内膜依赖性收缩反应的可能机制(1)缝隙连接蛋白对缺氧血管钙敏感性的影响:缺氧1h血管环的钙敏感性较正常组血管环明显增加,缺氧3h血管环的钙敏感性较正常组明显降低;Cx40AODN可以明显增加各组血管环的钙敏感性;Cx43AODN可以明显降低各组血管环的钙敏感性。实验结果说明Cx40具有降低血管钙敏感性的作用,Cx43具有促进血管钙敏感性的功能;Cx40和Cx43调节血管钙敏感性的作用与休克后血管收缩反应性的变化规律呈正相关关系。(2)缝隙连接蛋白对缺氧血管MLCP活性的影响:缺氧1h血管的MLCP活性降低;缺氧3h血管的MLCP活性升高。Myricetin可以引起MLCP活性降低;在Myricetin的作用条件下,Cx40AODN引起MLCP的活性降低;Cx43AODN引起血管MLCP的活性升高。实验结果说明Cx40具有增加血管MLCP活性的作用,Cx43具有抑制血管MLCP活性的作用;Cx40和Cx43调节血管MLCP活性的作用与休克后血管收缩反应性变化呈负相关关系。(3)缝隙连接蛋白对缺氧血管MLC20磷酸化的影响:缺氧引起各组血管的MLC20磷酸化水平降低;Myricetin可以明显增加正常组和缺氧1h组血管的MLC20磷酸化水平,Cx40AODN可进一步增加Myricetin作用下血管的MLC20磷酸化水平,Cx43AODN可降低Myricetin作用下血管的MLC20磷酸化水平。缺氧3h组血管的MLC20磷酸化水平明显降低,Cx40AODN可升高Myricetin作用下的缺氧3h血管的MLC20磷酸化水平,Cx43AODN对Myricetin作用下的缺氧3h血管的MLC20磷酸化水平无明显影响。实验结果说明,在Myricetin作用条件下,Cx40具有降低血管MLC20磷酸化水平的作用,Cx43具有增加血管MLC20磷酸化水平的作用;Cx40和Cx43调节血管MLC20磷酸化水平的作用与休克后血管收缩反应性的变化呈正相关关系。(4)缝隙连接蛋白对缺氧血管MLCK活性的影响:缺氧1h组血管的MLCK活性升高;缺氧3h组血管的MLCK活性降低。Myricetin对缺氧血管MLCK活性无影响,在Myricetin的作用条件下,Cx40AODN和Cx43AODN对SMA的MLCK活性无明显影响。实验结果说明Cx40和Cx43对缺氧血管的MLCK活性无明显作用,Cx40和Cx43调节血管MLCK活性的作用与休克后血管收缩反应性的变化无关。(5)缝隙连接蛋白对缺氧VSMC的[Ca2+]i的影响:缺氧后30min和2h VSMC的[Ca2+]i进行性增高;Myricetin可以引起[Ca2+]i明显增加;在Myricetin作用条件下,Cx40AODN可以引起VSMC的[Ca2+]i增加,Cx43AODN可以引起VSMC的[Ca2+]i降低。说明Cx40可以降低VSMC的[Ca2+]i,Cx43可以增加VSMC的[Ca2+]i;Cx40和Cx43调节VSMC的[Ca2+]i的作用与休克后血管收缩反应性的变化呈正相关关系。4、MEGJ调节休克后内膜依赖性血管舒张反应的可能机制(1)缝隙连接蛋白对缺氧血管MLCP活性的影响:Ach可以引起血管MLCP活性升高;在Ach的作用条件下,Cx40AODN和Cx43AODN对MLCP的活性无明显影响。说明在Ach的作用条件下,Cx40和Cx43对缺氧血管MLCP的活性无明显作用,与休克后血管舒张反应性的变化无关。(2)缝隙连接蛋白对缺氧血管MLCK活性的影响:Ach可以引起MLCK活性明显降低,在Ach的作用条件下,Cx40AODN和Cx43AODN对SMA的MLCK活性无明显影响。实验结果说明,在Ach的作用条件下,Cx40和Cx43对缺氧SMA的MLCK活性无明显作用,与休克后血管舒张反应性的调节作用无关。(3)缝隙连接蛋白对缺氧VSMC [Ca2+]i的影响:Ach可以引起VSMC的[Ca2+]i降低;在Ach作用条件下,Cx40AODN和Cx43AODN对[Ca2+]i无明显影响。说明在Ach作用条件下,Cx40和Cx43对[Ca2+]i无明显作用,与休克后血管舒张反应性的变化无关。结论:1.失血性休克大鼠血管的收缩反应和舒张反应在休克早期呈高反应性,在休克晚期呈低反应性;MEGJ在失血性休克大鼠内膜依赖性的血管收缩反应和舒张反应变化中具有重要的调节作用。2.Cx40与休克血管反应性的变化呈负相关关系,即,在血管高反应期表达降低,在血管低反应期表达增加;Cx40具有抑制休克后内膜依赖性的血管舒张反应和收缩反应的作用。Cx43与休克血管反应性的变化呈正相关关系,即,在血管高反应期表达增加,在血管低反应期表达降低;Cx43具有促进休克后内膜依赖性的血管舒张反应和收缩反应的作用。3.MEGJ参与调节休克后内膜依赖性血管收缩反应的可能机制:在休克代偿期, Cx43的表达增加,Cx40的表达降低,其结果是降低了MLCP的活性,使MLC20的去磷酸化作用降低,MLC20的磷酸化水平增加,血管的钙敏感性增加,VSMC的[Ca2+]i增加,表现出血管收缩反应性的代偿性增加;在休克失代偿期,发生相反的变化,表现出血管收缩反应性的失代偿;同时,在休克失代偿期Cx40的表达增加,Cx43的表达降低,可以部分降低VSMC的[Ca2+]i,从一定程度上缓解休克晚期VSMC内的钙超载。4.MEGJ调节休克后内膜依赖性的血管舒张反应的机制与MLCP/MLCK、MLC20磷酸化程度及钙敏感性无关,可能与Cx40和Cx43通道对超极化的化学信号或电信号的通透性有关,其具体机制尚需进一步研究阐明。