近年来研究发现,对多糖进行分子修饰可以大大提高其生物活性,并能产生许多新的药用价值。为了提高多糖的生物活性,可以选择合适的方法对多糖进行分子修饰。黄精多糖和牛膝多糖分别是中药黄精和牛膝的主要有效成分,具有增强免疫、抗病毒、抗肿瘤、抗应激、抗氧化等多方面的生物活性。为了追踪两种多糖抗病毒和增强免疫的活性部位和硫酸化修饰进一步提高两种多糖抗病毒和增强免疫活性的可能性,本研究选择黄精多糖和牛膝多糖为研究对象,首先用一步醇沉法和分步醇沉法提取总多糖和分级多糖,比较它们的体外抗病毒和增强免疫活性,筛选出效果较好的活性部位,并进一步进行硫酸化修饰,比较了硫酸化多糖的抗病毒和增强免疫活性。试验分为以下九个部分：试验I、黄精多糖和牛膝多糖的提取分别用水煎一步醇沉和分步醇沉法从黄精和牛膝饮片中提取黄精总多糖(SRPSt)和4个分级黄精多糖(SRPS30、SRPS50、SRPS70、SRPS80)、牛膝总多糖(ARPSt)和4个分级牛膝多糖(ARPS30、ARPS50、ARPS60、ARPS70),分别用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝G-250法测定多糖和蛋白含量。结果表明,黄精多糖的提取率以SRPSt最高,达13.84%；分级多糖的得率以SRPS50最高、为4.88%,SRPS30最低、仅为0.38%；黄精多糖的糖含量以SRPS50最高、达77.43%；蛋白含量以SRPS30最高、为4.8%,SRPS50最低、为0.83%。牛膝多糖的提取率以ARPSt最高,为2.48%；糖含量以ARPS70最高、达32.89%,ARPS30最低,仅为10.55%；蛋白含量以ARPS70最高、为1.84%, ARPSt 和 ARPS40最低、微量。试验Ⅱ、两种多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响为了筛选两种多糖抗病毒的活性部位,首先用MTT法测定上述黄精总多糖和4个分级多糖、牛膝总多糖和4个分级多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的安全浓度,取安全浓度范围内5种浓度的各多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加入到长成单层CEF的培养体系中,用MTT法测定NDV感染CEF能力的变化。结果表明,在先加多糖时SRPS50、SRPS70、SRPS80、 SRPSt、 SRPS30和SRPS70在1.94～31.25μg·mL-1、 SRPS50在3.92～31.25μg·mL-1、ARPS70 和 ARPSt在19.53～156.25μg·mL-1、显著抑制NDV感染CEF。后加多糖时,SRPS30和SRPS70在1.94～31.25μg·mL-1、SRPS50在3.92～31.25μg·mL-1、SPSP80在3.92～7.84 μg·mL-1、SRPSt 在31.25 μg·mL-1、ARPS30在19.53～39.06 μg·mL-1、ARPS60在19.53μg·mL-1、 ARPSt在39.06μg·mL-1、显著抑制NDV感染CEF。多糖和病毒感作后加时SRPS30、SRPS50、SRPS70、SRPS80在1.94～31.2μg·mL-1显著抑制NDV感染。综合比较以SRPS30、SRPS50、SRPS70、ARPSt的抗病毒活较好,可能是黄精多糖和牛膝多糖抗病毒活性的最佳部位。试验Ⅲ、两种多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响为了筛选两种多糖增强免疫的活性部位,将安全浓度范围内5个浓度的上述黄精总多糖和4个分级多糖、牛膝总多糖和4个分级多糖分别单独或与PHA加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,SRPS单独加入时,SRPS50.SRPS70和SRPS80在1.953～31.25μg·mL-1、SRPS30在31.25μg·mL-1-‘显著刺激淋巴细胞增殖,SRPS70组的增殖率最高；SRPS与PHA一起加入时,SRPS30和sRPS70在31.25 μg·mL-1、SRPs50在1.953～31.25 μg·mL-1、SRPS80在1.953 μg·mL-1、显著刺激淋巴细胞增殖,SRPS50组的增殖率最高；ARPS单独加入时,ARPS30. ARPs70在19.53l～312.5μg·mL-1、ARPSt在78.12～312.5μg·mL-1显著促进淋巴细胞的增殖,ARPSt组的增殖率最高；ARPS与PHA一起加入时,ARPS50在312.5μg·mL-1、ARPS60在19.531μg·mL-1、ARPS70在19.531～312.5μg·mL-1、ARPSt在39.0625～312.5μg·mL-1显著促进淋巴细胞增殖,ARPSt组的增殖率最高。综合评价以RPS50.SRPS70.ARPSt的效果最好,可能是黄精多糖和牛膝多糖增强免疫活性的最佳部位。试验Ⅳ、两种多糖的纯化及硫酸化修饰条件的优选将SRPSt和ARPSt分别用三氯乙酸法除蛋白、过氧化氢去色素、DEAE-Sephadex A-50或SepradexG-100柱层析纯化。然后以产物量、硫酸基取代度(DS)和糖含量为指标,用正交设计法对两种多糖的硫酸化修饰条件(氯磺酸-吡啶比例、反应温度和反应时间)进行优选,用氯化钡-明胶法测定DS,红外光谱鉴定硫酸化多糖的结构。结果表明,黄精多糖经DEAE-Sephadex A-50柱层析显示1个糖峰、纯多糖得率为10%；牛膝多糖经Sephadex G-100柱层析显示两个糖峰,第二个峰糖含量及得率较高、得率达30%。反应温度对取代度的影响较大,氯磺酸与吡啶的体积比对产物量和糖含量影响均较大。综合考虑黄精多糖适宜的修饰条件为反应温度为70℃、氯磺酸与吡啶的体积比在1：4、反应时间2 h；牛膝多糖适宜的修饰条件为反应温度为85℃、氯磺酸与吡啶的体积比在1：4,反应时间1h。硫酸化多糖的红外光谱显示有两个特征性吸收峰,证明了硫酸基已经和多糖结合成酯。试验Ⅴ、两种硫酸化多糖体外对新城疫病毒感染细胞能力的影响 为了比较两种硫酸化多糖的抗病毒作用,按照上一试验对4个多糖进行纯化和硫酸化修饰,得到4个纯化多糖(SRPS50p、SRPS70p、SRPStp、 ARPStp)和4个硫酸化多糖(sSRPS50、sSRPS70、sSRPSt和sARPSt),用MTT法测定8个多糖和2个粗多糖(sARPStc、ARPStc)对CEF的安全浓度,然后将安全浓度内5种浓度的10个多糖与鸡新城疫病毒(NDV)以3种方式(先加多糖,后加多糖,多糖和病毒感作后)加入到CEF的培养体系中,用MTT法比较它们对新城疫病毒感染细胞能力的影响。结果显示,先加多糖时, sSRPS50、 sSRPS70、sARPSt、 sSRPSt在0.9775 μg·mL-1、其余多糖在3.91μg·mL-1时显著抑制NDV感染CEF；在后加多糖时sSRPS50、sSRPS70在0.2444～0.9775 μg·mL、ARPStp、SRPS50p和SRPS70p在0.2444～1.955μg·mL-1、sARPSt在0.2444μg·mL-1时显著抑制NDV感染CEF；多糖和病毒感作后加时,除了ARPStc外其余多糖均显著抑制NDV感染CEF。综合比较以SRPS50p和sARPSt制NDV感染细胞的作用较强,表明硫酸化修饰能够提高牛膝多糖的抗病毒活性。试验Ⅵ、两种硫酸化多糖体外对鸡外周血淋巴细胞增殖的影响 为了比较两种多糖的增强免疫作用,将安全浓度范围内5种浓度的上述10个多糖分别单独或与PHA一起加入到鸡外周血液淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定淋巴细胞增殖的变化。结果显示,多糖单独加入时,sSRPS50、sSRPS70、sARPSt在0.2444～3.91 μg·mL-1, sSRPSt在0.2444～0.9775 μg·mL-1、SRPS70p在0.2444～1.955 μg·mL-1、ARPStp和 SRPStp在0.4887-1.955 μg·mL-1、SRPS50p在0.4887～0.9775 μg·mL-1, ARPStc在0.2444μg·mL-1显著促进淋巴细胞增殖,sARPS,组的增殖率最高(91.7%)、其次是sSRPS50(75.59%)、sSRPS70 (68.3%)。与PHA一起加入时, sSRPS50在0.9775～1.955 μg·mL-1、sARPSt在0.2444～3.91μg·mL-1、SRPS70p在0.2444 μg·mL-1、SRPS50p在 0.4887～0.9775 μg·mL-1、ARPStp在0.2444～0.4887μg·mL-1协同PHA显著促进淋巴细胞增殖,sARPSt组的淋巴细胞增殖率最高,其次为SSRPS50和sSRPS70o综合比较以sSRPS50、sSRPS70和sARPSt的作用较强,表明硫酸化修饰能够提高黄精多糖和牛膝多糖的增强免疫活性。试验Ⅶ、两种硫酸化多糖对新城疫疫苗免疫应答的影响 为了比较两种硫酸化多糖的体内增强免疫作用,取14日龄非免疫健康罗曼蛋公鸡360羽,随机均分为12组,除空白对照(BC)组外均用新城疫Ⅳ系苗免疫,28日龄时二免。在首次免疫的同时,10个多糖组分别同时注射各种上述各多糖,无佐剂对照(NA)组和空BC组注射等量生理盐水,每天1次,连续3d。分别于首免后第7 (D7)、14 (D14)、21 (D21)和28(D28)d每组随机抽取4羽心脏采血,用MTT法测定外周血淋巴细胞增殖,每组随机抽取6只翼静脉采血,用p-微量法测定血清抗体效价。结果显示,sSRPS70、sSRPSt、sARPSt和SRPS50p组在D7、sSRPS50、sSRPS70、sARPSt、SRPS70p、SRPS50p、SRPStp和SRPStc组在D14. sSRPS 50、sARPSt.SRPS70p、SRPStp、SRPS50p组在D21、sARPSt和SRPS50p组在D28的淋巴细胞增殖显著高于NA组,4个时间点的平均淋巴细胞增殖率以SRPS50p组率最高(86.63%),其次为sARPSt(62.2%),两组显著高于NA组；各多糖组在免疫后各时间点的抗体效价均高于、在D14和D21显著高于NA组。综合比较以sARPSt、SRPS50p增强细胞免疫和体液免疫的作用均较强,表明硫酸化修饰能显著提高牛膝多糖的增强免疫活性。试验Ⅶ、两种硫酸化多糖对鸡新城疫的疗效的比较为了比较两种硫酸化多糖的体内抗病毒作用,取27日龄蛋公鸡420只,随机均分为12组,空白对照组隔离饲养,不作任何处理,其余11组均用新城疫强毒攻毒,攻毒6h后10个多糖组分别开始注射上述10个多糖,每天1次,连续3d,病毒对照组和空白对照组注射生理盐水。每天观察各组鸡的临床症状及死亡情况,对死亡鸡只及时剖检,于攻毒后第12d所有存活鸡全部剖检,统计临床疗效；分别于攻毒前1 d、攻毒后第3、7、14 d采血测定血清抗体效价。结果显示,各多糖组的死亡率均低于、总有效率均高于病毒对照组,sARPSt和sSRPS50组的死亡率和总有效率与病毒对照组的差异显著；各多糖组在攻毒后各时间点的抗体效价均高于攻毒对照组,sARPSt和sSRPS50组均高于病毒对照组。结果表明,各多糖对鸡人工感染新城疫有一定的疗效,sARPSt和sSRPS50的疗效最为显著。试验Ⅸ、两种硫酸化多糖对新城疫病毒NP基因mRNA表达的影响为了验证两种硫酸化多糖的抗病毒作用和机理,测定了sSRPS50.sARPSt和SRPS50p对感染CEF的NDV NP基因mRNA表达的影响。培养鸡胚成纤维细胞,待细胞长成单层后,吸出细胞培养液,加入NDV液2 mL,4℃作用30 min,吸出病毒液,分别加入2种浓度的sSRPS50.sARPSt和SRPS50p 2 mL,培养72 h后收集细胞,提取总RNA。用Primer Premier软件设计了一对特异性NDV的NP基因引物,扩增出176 bp的NP蛋白基因片段,用荧光定量RT.PCR方法测定NDVNP基因mRNA的相对表达量。结果显示,各多糖组的NDVNP基因mRNA的相对表达量均显著小于病毒对照组,sARPSt高剂量组最低,其次为sSRPS50高剂量组。结果表明,3种多糖均能显著抑制NDV在CEF中增殖,sARPSt的作用最强。