异育银鲫是方正银鲫与兴国红鲤人工授精繁育的养殖新品种,因其肉质鲜美、发育迅速、养殖周期短,而在中国大面积养殖,主养区在江苏等地。自2009爆发Ⅱ型疱疹病毒感染以来,因无有效治疗和预防措施,已造成直接经济损失五千多万元,严重影响了异育银鲫养殖产业的发展。为了探明爆发Ⅱ型疱疹病毒病是否与养殖环境,尤其是养殖环境中细菌生态因素有关联,本研究采用高通量测序及代谢组学技术,全面分析养殖池塘底泥的细菌群落、水体的细菌群落以及疱疹病毒感染对异育银鲫肠道细菌生态的影响,以期为采用微生态方法进行异育银鲫疱疹病毒病的防控提供基础数据。课题组于2015年5月和6月分别采集江苏大丰异育银鲫养殖池塘的水体和底泥样本各38份,进行正常养殖水体和底泥的细菌群落研究;健康鲫鱼肠道样本135份(5月49份、6月86份)进行正常的肠道细菌生态学研究;并自另外两个池塘采集了健康鲫鱼肠道样本32份、发病鲫鱼肠道样本60份,研究健康与受疱疹病毒感染发病的异育银鲫肠道细菌群落组成差异及肠道代谢组学差异。研究结果如下:1、不同时间和不同池塘的正常养殖水体细菌群落变化研究采用高通量测序技术分析水体样本所含细菌群落组成,并利用统计方法比较分析不同时间和不同池塘养殖水体细菌群落差异。研究结果发现:(1)不同时间比较:从α-多样性显示,5月和6月养殖水体细菌群落无显著差异;从优势菌含量上显示,养殖水体细菌群落中门水平上的8个优势菌中,有2个优势菌含量在6月显著降低,2个优势菌含量在6月显著增加,其他菌无显著差异;属水平上的7个优势菌中,有4个优势菌含量在6月显著降低,其他菌无显著差异;(2)不同池塘比较:从α-多样性显示,不同池塘间存在显著差异;从优势菌含量上显示,门水平上的8个优势菌中有7个优势菌在不同池塘的含量有显著差异,而属水平上的7个优势菌在不同池塘的含量均有显著差异。2、不同时间和不同池塘的正常养殖池塘底泥细菌群落变化研究采用高通量测序技术分析底泥样本所含细菌群落组成,并利用统计方法比较分析不同时间和不同池塘底泥细菌群落差异。研究结果显示:(1)不同时间比较:从α-多样性显示,5月和6月养殖池塘底泥细菌群落无显著差异;从优势菌含量上显示,养殖池塘底泥细菌群落中门水平上的7个优势菌中,有1个优势菌含量在6月显著降低,有2个优势菌含量在6月显著增加,其他菌无显著差异;属水平上的13个优势菌中,有1个优势菌含量在6月显著降低,1个优势菌含量在6月显著升高,其他菌无显著差异;(2)不同池塘比较:从α-多样性显示,不同池塘间存在显著差异;从优势菌含量上显示,门水平上有3个优势菌在各池塘含量有显著差异,而属水平上的11个优势菌在各池塘的的含量均有显著差异。3、不同时间和不同池塘的健康异育银鲫肠道细菌群落变化分析采用高通量测序技术分析肠道样本所含细菌群落组成,并利用统计方法比较分析不同时间和不同池塘养殖的健康异育银鲫肠道细菌群落组成差异。研究结果发现:(1)不同时间比较:从α-多样性显示,6月异育银鲫肠道细菌群落多样性显著下降;从优势菌含量上显示,肠道细菌群落中门水平上的10个优势菌中有6个优势菌含量在6月显著降低,1个优势菌含量在6月显著增加,其他菌无显著差异;属水平上的8个优势菌中,有3个优势菌含量在6月显著增加,有4个优势菌含量在6月显著降低,其他菌无显著差异;(2)不同池塘比较:从α-多样性显示,不同池塘间存在显著差异;从优势菌含量上显示,门水平上的10个优势菌及属水平上的8个优势菌在不同池塘的含量均有显著差异。4、养殖环境细菌群落与异育银鲫肠道细菌群落差异研究将异育银鲫肠道细菌群落与养殖水体、底泥中细菌群落比较分析,结果发现:(1)从a-多样性显示:底泥细菌群落多样性显著高于水体,而水体细菌群落多样性显著高于肠道;(2)从优势菌组成上显示:门水平上,肠道与水体细菌群落中有7种相同优势菌,肠道与底泥细菌群落中有6种相同优势菌,水体与底泥细菌群落中有6种相同优势菌;属水平上,肠道与水体细菌群落中有2种相同优势菌,肠道与底泥、水体与底泥细菌群落中中均无相同优势菌;(3)从变化趋势上显示:门水平上的优势菌比较,梭杆菌门在6月的肠道和水体中的含量均大幅增加,而底泥中无明显变化,变形菌门在6月的底泥和肠道中的含量略有下降,而水体中显著降低,放线菌门在6月的底泥和水体中的含量显著增加,而肠道中显著降低,拟杆菌门在6月的底泥和水体中的含量均为降低,而肠道中为增加;属水平上的优势菌比较,底泥中Synechococcus在6月的含量显著降低,而水体和肠道中显著增加,底泥中Lavobacterium在6月的含量显著降低,而水体和肠道中仅略有降低,底泥中Anoxybacillus在6月的含量显著增加,而在水体和肠道中却显著降低。5、疱疹病毒感染对异育银鲫肠道细菌群落的影响采用高通量测序技术分析样本所含细菌群落组成,并利用统计方法比较分析健康的与受疱疹病毒感染发病的异育银鲫肠道细菌群落组成差异。分析结果发现:(1)从α多样性显示:病鱼肠道微生物多样性显著低于健康鱼;(2)从优势菌含量显示:门水平上的11个优势菌中有3个优势菌在病鱼肠道中的含量显著增加,有6个优势菌在病鱼肠道中的含量显著降低,其他菌无显著差异;属水平上的11个优势菌中有4个优势菌在病鱼肠道中的含量显著增加,有4个优势菌在病鱼肠道中的含量显著减少,其他菌无显著差异。经ROC曲线分析,Plesiomonas可作为Ⅱ型疱疹病毒感染预警的细菌性指示物。6、Ⅱ型疱疹病毒感染对异育银鲫肠道代谢物影响研究利用高分辨质谱进行异育银鲫肠道代谢组学分析,研究结果发现:异育银鲫肠道代谢物主要为氨基酸、脂肪酸、胆碱、嘌呤等。Ⅱ型疱疹病毒感染导致了异育银鲫肠道代谢物显著变化,在正离子模式下检测到5073种代谢物含量上调,2850种代谢物含量下调,在负离子模式下检测到1597种代谢物含量上调,1556种代谢物含量下调。经搜库比对共鉴定得到20种显著下调物质,4种显著上调物质,其中具有提高免疫力,增强抗病毒能力的物质如β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、大豆苷元、三羟异黄酮、阿魏酸等在受Ⅱ型疱疹病毒感染的异育银鲫肠道代谢物中含量显著降低,而烟酰胺、N1乙酰精胺等物质的含量显著增加。综上所述,本文通过对养殖环境和肠道细菌类群的分析,判明了异育银鲫养殖环境细菌群落及Ⅱ型疱疹病毒感染对其肠道细菌生态的影响,筛选出一种可用于Ⅱ型疱疹病毒感染预警的细菌性指示物;同时,通过代谢组学分析了多种免疫增强物质对Ⅱ型疱疹病毒感染的作用,研究结果为异育银鲫疾病的预防和治疗提供了基础资料。