光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是利用激光的光化学原理，通过特定波长的激光激活肿瘤组织内滞留的光敏剂，与肿瘤组织内的氧发生作用，产生一些活性氧分子(radical oxygen species，ROS)，并通过氧化作用攻击细胞结构，造成细胞膜或蛋白质的氧化损伤，当氧化损伤的积累超过一定的阈值时，细胞便开始死亡。另外，还可造成肿瘤微血管急性损伤。与常规的手术、化疗等疗法相比，PDT具有以下优点：(1)创伤小；(2)毒性小；(3)选择性好；(4)适用性好；(5)重复性好；(6)可姑息治疗；(7)可消灭隐性病灶；(8)可保护容貌及重要器官。目前已开始应用于多种恶性肿瘤的治疗，日渐成为肿瘤治疗新手段。食管癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，而我国是高发国家。随着新型光敏剂的发展及半导体激光发生系统的开发，PDT在食管癌尤其是早期食管癌及癌前病变的治疗上已取得较大进展。但临床治疗中发现，肿瘤光动力治疗疗效不稳定是非常常见的问题。同样是食管癌有的患者光动力治疗后可以达到临床治愈的水平，而有的却疗效不佳。究其原因可能是肿瘤组织中氧含量、光敏剂浓度的不同以及肿瘤组织对光敏剂敏感程度不同所致。因此本实验以第一代光敏剂血卟啉衍生物(Hematoporphyrin derivative，HPD)及Photofrin在特定光源下作用于人食管鳞癌细胞Eca-109，以初步探讨HPD、Photofrin两者光敏剂不同孵育浓度、孵育时间及不同光照能量密度等因素对其体外PDT效应的影响。同时建立人食管癌裸鼠模型，给予行HPD-PDT、Photofrin-PDT、5-ALA-PDT后观察治疗组与对照组治疗前后瘤组织体积、肿瘤表面皮肤变化及瘤组织HE染色情况，并监测PDT后第3天肿瘤组织中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量、survivin、caspase-3蛋白表达情况，以初步探讨人食管癌荷瘤裸鼠PDT效应主要影响因素及作用机制。第一部分人食管鳞癌细胞Eca-109体外光动力效应主要影响因素的研究一、研究方法及内容1、HPD-PDT对人食管鳞癌细胞Eca-109生长曲线的影响：通过MTT法监测不同HPD孵育浓度对Eca-109细胞生长的影响，并将酶标仪Bio-Rad550测得的OD值绘制不同孵育浓度下Eca-109细胞的生长曲线。2、Eca-109的体外光动力效应：以两种光敏剂HPD和Photofrin不同孵育浓度(0ug／ml，0.1ug／ml，0.75ug／ml，1.5ug／ml，3.0ug／ml，6.0ug／ml，10.0ug／ml，20.0ug／ml)和不同孵育时间(分别孵育4h、6h、12h、24h)于饱和光照能量密度(20J／cm~2)下以及不同孵育浓度(Photofrin孵育浓度为：0ug／ml，0.05ug／ml，0.375ug／ml，0.75ug／ml，1.5ug／ml，3.0ug／ml，5.0ug／ml，10.0ug／ml，HPD孵育浓度为：0ug／ml，0.1ug／ml，0.75ug／ml，1.5ug／ml，3.0ug／ml，6.0ug／ml，10.0ug／ml，20.0ug／ml)于三种不同光能量密度(10J／cm~2，30J／cm~2，50J／cm~2)下作用于人食管癌细胞Eca-109，光源采用DIOMED630PDT系统，光照后避光孵育24小时，通过MTT法检测细胞生存率。统计学处理采用Spss13.0统计软件，实验结果以“均数±标准差”表示，统计方法采用析因设计的方差分析，细胞生存率与浓度间的关系采用曲线拟合。3、荧光分光光度法检测胞内实际HPD浓度：给予不同浓度HPD(孵育浓度为：1.5ug／ml，3.0ug／ml，6.0ug／ml，10.0ug／ml)孵育Eca-109细胞4小时后，去培养液，加入去离子水反复冻融后取上清于荧光分光光度计RT-5000检测胞内光敏剂荧光值。HPD标准曲线的绘制：取纯细胞冻存液，加入HPD使其终浓度分别为0ug／ml，0.008ug／ml，0.016ug／ml，0.064ug／ml，0.128ug／ml，0.150ug／ml，于荧光分光光度计RT-5000检测荧光值，并依据测得的荧光值与HPD浓度绘制标准曲线。统计学处理软件同上，光敏剂孵育浓度与胞内实际光敏剂浓度间的相关性采用线性回归分析。二、主要结果1、从绘制的OD值曲线可见，随着HPD孵育浓度的增高，其OD值呈下降趋势，表明浓度越高，其细胞存活越少，即HPD-PDT对其细胞生长影响越大。但当浓度由10ug／ml增至20ug／ml时其OD值未见明显下降。2、Photofrin、HPD两者三种不同光照能量密度及不同浓度下其生存率间均有明显差异，且二者之间存在显著的交互效应，P值均＜0.01。同一光照能量密度下两者不同孵育浓度间的生存率均有显著差异，P值均＜0.01。而同一浓度下不同光照能量密度间的生存率，Photofrin除了浓度为10.0ug／ml，HPD除了浓度为20ug／m1外之间均有明显差异，P值均＜0.05。当Photofrin浓度为10ug／ml，光照能量密度为10J／m~2时其生存率最低，而当其浓度由5.0ug／ml增至10ug／ml时，光照能量密度由10J／m~2增加至50J／m~2时不能提高杀伤效应。当HPD浓度为20ug／ml，光照能量密度为30J／cm~2时其杀伤效应最强，当其浓度为6ug／ml至20ug／ml时，光照能量密度由30J／cm~2增加至50J／cm~2时不能提高杀伤效应。3、Photofrin、HPD四中不同孵育时间和不同孵育浓度下生存率间均有显著差异，且二者之间存在显著的交互效应，P值均＜0.01。同一孵育时间下两种光敏剂不同浓度间的生存率均有显著差异，P值均＜0.01。同一浓度下不同孵育时间之间的生存率，Photofrin除了浓度为0ug／ml和0.1ug／ml，HPD除了浓度为0ug／ml外均有明显差异，P值均＜0.05。当Photofrin浓度为10.0ug／ml，孵育时间为24小时其生存率最低，其浓度由10.0ug／ml增加为20ug／ml时，孵育时间由12小时延长为24小时并不能提高杀伤效应。HPD浓度为10ug／ml，孵育时间12小时其杀伤效应最强，当其浓度为6.0ug／ml和20ug／ml时，其孵育时间由12小时延长24小时并不能增强其杀伤效应。4、孵育4小时、6小时、12小时、24小时下不同浓度Photofrin与细胞生存率间的拟合曲线方程分别为Y=1.042—0.241X+0.058X~2-0.005X~3，Y=1.120—0.305X+0.054X~2-0.003X~3，Y=0.837+0.017X+0.034X~2+0.003X~2，Y=0.920—0.019X—0.041X~2+0.004X~3，并依据拟合曲线方程分别求得其半数杀伤浓度为0.935ug／ml，0.981ug／ml，0.837ug／ml，0.901ug／ml，孵育4小时、6小时、12小时、24小时下不同浓度HPD与细胞生存率间的拟合曲线方程分别为Y=0.771+0.029X—0.005X~2-0.001X~2，Y=1.012—0.247X+0.059X~2-0.005X~3，Y=0.712+0.119X—00062X~2+0.005X~3，Y=0.953—0.153X+0.006X~2+0.002X~3，并依据拟合曲线方程分别取得其半数杀伤浓度为0.784ug／ml，0.903ug／ml，0.757ug／ml，0.875ug／ml。5、标准曲线回归方程为Y=0.86X-0.083，相关系数R=0.963，F=50.482，P=0.002。根据标准曲线及测得的胞内光敏剂荧光值求得胞内光敏剂浓度，与孵育浓度作相关回归分析，得回归方程Y=12.521+0.001X，相关系数R=0.998，F=451.724，P=0.002。因此，胞内光敏剂的实际浓度与孵育浓度呈正相关。从上述HPD孵育Eca-109细胞4小时后行MTT实验结果可见，随着相应孵育浓度增加，其生存率降低，即杀伤效应越强，而孵育浓度和胞内浓度呈正相关，从而进一步说明其体外光动力效应随着孵育浓度增加而呈增强趋势主要是由于进入胞内光敏剂浓度的增加。三、主要结论1、随着孵育HPD浓度的增加，其HPD-PDT对Eca-109抑制或杀伤作用越明显，但浓度由10ug／ml增加为20ug／ml时，其杀伤或抑制效应无明显增强，即达到平台期。2、Eca-109细胞体外PDT效应最佳杀伤效应的光照能量密度和孵育浓度点为：Photofrin孵育浓度为10ug／ml，光照能量密度为10 J／cm~2；HPD浓度为20ug／ml，光照能量密度为30 J／cm~2；最佳杀伤效应的孵育时间和孵育浓度点：Photofrin孵育浓度为10.0ug／ml，孵育时间为24小时；HPD孵育浓度为10ug／ml，孵育时间为12小时。四种不同孵育时间下HPD的半数杀伤剂量均小于Photofrin，从剂量上看Eca—109细胞对HPD更敏感。3、通过荧光分光光度法检测胞内荧光值，结果示胞内实际光敏剂浓度与孵育浓度成正相关，从而进一步说明其体外光动力效应随着孵育浓度增加而呈增强趋势主要是由于胞内光敏剂浓度的增加。第二部分HPD-PDT、Photofrin-PDT、5-ALA-PDT抑制人食管鳞癌荷瘤裸鼠效应的实验研究一、研究方法及内容建立人食管鳞癌裸鼠肿瘤模型，每3天监测肿瘤瘤径，待肿瘤大小为150～300mm~3时，开始给予行光动力治疗。实验分对照组和光动力治疗组，对照组包括完全空白对照组(不作任何处理)和单纯光照组(只给予光照)。光动力治疗组按给予光敏剂不同分为HPD组，Photofrin组、5-ALA组。每组7只。HPD组按30mg／Kg，Photofrin组按10mg／Kg，5-ALA组按100mg／Kg腹腔给药，HPD组及5-ALA组于给药后4小时，Photofrin组则给药24小时后开始进行光动力治疗。光源采用DIOMED630 PDT系统，按120J／cm2光能量密度进行光照，光照后监测肿瘤体积及观察肿瘤表明皮肤的变化，并于治疗后第3天(每组3只1，21天(每组4只)分别处死部分裸鼠，取瘤组织进行MDA，HE染色，survivin、caspase-3蛋白组化的检测。统计学软件采用SPSS13.0，各组体积的比较采用重复测量数据的方差分析，肿瘤组织MDA含量的比较及治疗组与空白对照组survivin、caspase-3阳性率比较均采用单向方差分析(One-way ANOVA)。二、主要结果1、肿瘤表面皮肤变化：光动力治疗后对照组肿瘤组织表面皮肤未见明显变化，肿瘤组织增长相对治疗组较快，治疗组于PDT第1～3天则可见肿瘤表面皮肤发红，局部皮肤红斑样变，并有出现水肿、水泡，创面渗液外溢现象，有的出现组织坏死，溃疡形成。治疗后第7天，出现瘤体萎缩，溃疡面形成棕色痂皮，21天左右溃疡基底面新生上皮逐渐形成，痂皮脱落。2、肿瘤体积治疗前后对照组与治疗组的比较：各治疗组治疗后体积与对照组相比增长均较缓慢。不同组别及各组治疗前后的体积之间均有显著差异，且两种存在显著交互效应，P值均＜0.01。治疗前及治疗后四个不同时间段，对照组与各治疗组间的体积除了治疗前无明显差异外，其余均有明显差异，P值均＜0.05。各组治疗前后的体积之间也有显著差异，P值均＜0.01。3、HPD-PDT组、Photofrin-PDT组、5-ALA-PDT组肿瘤组织中MDA含量均高于空白对照组肿瘤组织的MDA含量，单向方差分析结果示，其P值均＜0.05，其差异有统计学意义。4、HE染色：对照组见大量异型瘤细胞，可见癌巢，血管内皮细胞完整。HPD-PDT和Photofrin-PDT治疗组可见坏死处呈均质红染，血管内皮广泛破坏，内皮细胞边界模糊，胞核消失，血管腔消失。而5-ALA-PDT组可见部分坏死肿瘤细胞，但血管内皮比较完整。5、免疫组化结果：HPD-PDT、5-ALA-PDT肿瘤组织中caspase-3表达阳性率与空白对照组相比，阳性率均高于空白对照组。相反，Survivin在上述两个治疗组的表达阳性率则均低于空白对照组。t检验结果示：caspase-3、survivin阳性表达率除空白对照组与HPD组间的caspase-3表达阳性率不存在明显差异外，其余各治疗组与空白对照组相比均存在明显差异，P值均＜0.05。主要结论：1、光动力治疗可使肿瘤增长趋势相对缓慢。2、HPD、Photofrin、5-ALA三种光敏剂于PDT作用过程中产生单态氧，攻击细胞膜发生脂质过氧化反应产生MDA等产物并损伤肿瘤细胞是其PDT过程的主要作用机制。HPD、Photofrin两种光敏剂在光动力效应过程中还可致肿瘤微血管的急性损伤。3、5-ALA-PDT过程中可能激活caspase-3凋亡通路。