稽留流产(missed abortion)又称过期流产,指宫内胚胎或胎儿死之后未及时排出,是流产的一种特殊形式。目前稽留流产在我国的发生率高达13.4%,随着国家二孩生育政策的放开,高龄孕妇增加,其发病率有逐年增加的趋势,给社会和家庭带来沉重的负担。稽留流产由于其胎盘组织机化,与子宫壁粘连,不易剥离,若稽留时间过长,退变胎盘可释放凝血活酶进入母体循环,导致严重的凝血功能障碍,甚至引发DIC,危害孕妇生命,是临床上较为棘手的一种流产类型。目前研究发现50%稽留流产与染色体异常、免疫因素、内分泌因素、生殖系统畸形、环境因素等密切相关,另外50%病因不明,且稽留流产的发病机制仍不明确。妊娠是一个复杂的生理过程,母胎界面是母体与胎儿之间进行气体交换、营养物质运输及清除废弃物的部位,而该界面上的滋养细胞是该功能的重要承担者,研究发现,滋养细胞在多种机制的共同作用下调控其增殖、凋亡、侵袭性及血管重铸等多种生物学特性,以确保正常妊娠的进行。滋养细胞功能障碍可能导致一系列胎盘功能障碍性疾病的发生,如流产、胎儿宫内生长受限、死胎、先兆子痫等。国内外研究表明,在妊娠早期,母胎循环建立之前,胚胎和胎盘在生理性低氧状态下生存,即滋养细胞处于生理性低氧环境中。同时,在肿瘤、缺血缺氧性脑病等疾病中,已有大量研究发现,低氧可以诱导自噬,且主要是通过HIF-1α/BNIP3信号通路实现的,并且低氧自噬与细胞的凋亡、侵袭性等具有重要关系,因此认为低氧自噬可能与胎盘的功能异常具有重要关系,在稽留流产的发生发展中起重要作用。妊娠早期的生理性低氧是胎盘侵袭和发育过程中的关键因素,Rodesch等发现妊娠8周时胎盘绒毛间质中氧浓度低于20 mm Hg(2.67 Kpa),并在妊娠11-12周时达到高峰。已有研究表明,作为氧平衡的重要调节因子,滋养细胞中缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1)在妊娠早期升高,并于妊娠7-9周达到高峰,11-12周时开始下降,对于胎盘在低氧环境的耐受起到重要作用。有研究发现HIF-1α在早期正常妊娠妇女滋养层细胞中表达,而在稽留流产绒毛组织中其表达则显著减少。HIF-1由α和β两种亚基构成,其中HIF-1β是结构性亚基,呈稳定性表达,HIF-1α是功能性亚基,其表达受氧含量的调节,缺氧时在细胞内积聚增多并与HIF-1β发生二聚化后转移至核内调控一系列下游基因的表达。BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19k Da interacting protein 3),即BCL2/腺病毒E1B19k Da相关蛋白3,是HIF-1α的重要下游靶基因,其启动子区域含有低氧反应元件,在低氧时可与HIF-1α相结合进而表达升高。BNIP3的N端具有BH3结构域,与线粒体自噬相关,可与Beclin1竞争破坏Beclin1-Bcl2或Beclin1-Bcl-XL复合体,使Beclin1游离从而引起自噬。LC3(Light chain 3,轻链3)是自噬的重要标志物,有两种类型,当自噬形成时,LC3Ⅰ可以转变为LC3Ⅱ,后者始终定位于自噬体膜上,因此LC3Ⅱ/Ⅰ可以表示自噬水平的高低。自噬,又被称为Ⅱ型程序性细胞死亡,是一种高度保守的细胞降解过程,其将部分胞质和细胞器隔离在双层膜的囊泡(自噬体)中,再运送到降解性的细胞器(液泡/溶酶体)中进行分解,最终对分解所产生的大分子予以回收利用,其在所有真核生物细胞中普遍存在,当缺氧、营养不足及损伤时作为一种应激反应出现。此过程可缓解多种应激因素对细胞的不利作用,在细胞的发育和分化过程中起至关重要的作用,此外,自噬涉及多种疾病,包括肿瘤、神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森症及亨廷顿症)、糖尿病、器官移植及衰老,而与妊娠期疾病的相关研究则鲜有报道。目的本研究以稽留流产孕妇绒毛组织为研究对象,通过对HIF-1α/BNIP3信号通路的重要蛋白进行检测,观察HIF-1a/BNIP3诱导自噬在稽留流产患者滋养层细胞中的变化情况,探讨HIF-1a/BNIP3诱导自噬与稽留流产发生的关系,进一步为稽留流产的防治提供理论依据。资料和方法1一般资料收集2015年10月至2016年4月在郑州大学第三附属医院产科经B超及β-h CG动态监测结合临床证实为稽留流产患者30例;稽留流产的诊断标准参照《妇产科学》(第8版),选取同期经B超证实为活胎、因非意愿妊娠行人工流产术的正常早孕妇女30例。两组孕妇年龄为20-45岁,孕龄为7-9w;均为单胎,既往均无高血压、糖尿病及甲状腺功能亢进等其它全身性疾病病史;无吸烟、长期服用药物史;抗核抗体、抗心磷脂抗体、抗精子抗体、抗内膜抗体、抗卵巢抗体检查无异常;风疹病毒Ig M、巨细胞病毒Ig M、单纯疱疹病毒Ig M、弓形虫Ig M、生殖道支原体、衣原体检查无异常;生殖器解剖结构无异常;绒毛染色体检查无异常;孕期无急、慢性感染性疾病。所有研究对象均对该研究知情同意,已经过伦理委员会的批准。2实验方法2.1标本采集于人工流产术后3min内,快速收集绒毛组织并用无菌生理盐水冲洗干净。将绒毛分为4份,1份置于体积分数10%甲醛溶液中,固定24 h后行脱水、石蜡包埋及切片,另2份置于高压灭菌冻存管中,并迅速放入液氮罐中,过夜后置于-80℃冰箱保存,最后1份取大约1 mm3的绒毛组织置于2.5%戊二醛中4℃保存,制成超薄切片,用于电镜观察。2.2实时荧光定量PCR技术提取两组绒毛组织总RNA,检测总RNA的完整性、浓度及纯度,并进行逆转录,采用2-△△Ct法检测两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3的m RNA相对表达水平。2.3免疫组化将两组绒毛组织处理并制作石蜡切片,用免疫组织化学SP法检测绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表达,以PBS做阴性对照,以镜下细胞质和核内出现明显高于背景颜色的棕黄色或棕褐色为阳性表达。2.4蛋白印迹法提取组织总蛋白,用蛋白印迹法检测两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3及LC3蛋白的表达水平。2.5透射电镜将两组绒毛组织处理并制作超薄切片,在透射电镜下观察两组绒毛组织中自噬体的数量。3统计学分析应用SPSS 19.0软件对数据进行统计学分析处理,实验结果均采用(?)±s表示,两组间比较采用两独立样本t检验,采用Pearson法进行相关性分析,以α=0.05作为检验标准。结果1一般情况比较稽留流产组患者平均年龄为28.04±3.496岁,平均孕龄为58.70±8.636d;正常早孕组患者平均年龄为30.09±5.206岁,平均孕龄为62.87±12.593d,两组间相比,差异无统计学意义(P>0.05)。2两组绒毛组织中HIF-1α、BNIP3、LC3蛋白的表达两组绒毛组织中均可见HIF-1α、BNIP3及LC3的棕黄色染色颗粒,在合体滋养层细胞与细胞滋养层细胞中均有表达,其中,HIF-1α主要定位于滋养层细胞胞核中,BNIP3蛋白及LC3蛋白主要定位于滋养层细胞胞质中。3两组绒毛组织中HIF-1αm RNA和蛋白的表达3.1两组绒毛组织中HIF-1αm RNA的相对表达水平稽留流产组绒毛组织中HIF-1αm RNA的相对表达水平为1.11±0.42,正常早孕组绒毛组织中HIF-1αm RNA相对表达水平为1.00±0.39,稽留流产组与正常早孕组相比HIF-1αm RNA表达水平无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05)。3.2两组绒毛组织中HIF-1α蛋白相对表达水平稽留流产组绒毛组织中HIF-1α蛋白的相对表达水平为0.226±0.053,正常早孕组绒毛组织中HIF-1α蛋白相对表达水平为0.432±0.055,稽留流产组与正常早孕组相比HIF-1α蛋白表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4两组绒毛组织中BNIP3 m RNA和蛋白的表达4.1两组绒毛组织中BNIP3m RNA的相对表达水平稽留流产组绒毛组织中BNIP3m RNA的相对表达水平为0.75±0.27,正常早孕组绒毛组织中BNIP3m RNA相对表达水平为0.99±0.37,稽留流产组与正常早孕组相比BNIP3m RNA表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.2两组绒毛组织中BNIP3蛋白相对表达水平稽留流产组绒毛组织中BNIP3蛋白的相对表达水平为0.524±0.340,正常早孕组绒毛组织中BNIP3蛋白相对表达水平为1.461±0.487,稽留流产组与正常早孕组相比BNIP3蛋白表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。5两组绒毛组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表达稽留流产组绒毛组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相对表达水平为3.227±2.601,正常早孕组绒毛组织中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达水平为16.592±6.248,稽留流产组与正常早孕组相比LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。6两组绒毛组织中HIF-1α与BNIP3、BNIP3与LC3Ⅱ/Ⅰ、HIF-1α与LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相关性分析结果显示,两组绒毛组织中HIF-1α与BNIP3蛋白呈正常相关关系(r=0.837),具有统计学意义(P<0.05);两组绒毛组织中BNIP3与LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白呈正常相关关系(r=0.876),具有统计学意义(P<0.05);两组绒毛组织中HIF-1α与LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白呈正常相关(r=0.853),具有统计学意义(P<0.05)。7透射电镜观察自噬体在正常对照组和稽留流产组绒毛组织中均可观察到自噬体样的双层膜结构的产生,但可以观察到稽留流产组自噬体减少,结构不典型。结论滋养层细胞中HIF-1α/BNIP3诱导自噬参与稽留流产的发生发展。