目的近年来,糖尿病(Diabetes mellitus,DM)的患病率在世界范围内呈明显上升趋势,而且发病更趋年轻化。目前主要以口服药物和注射胰岛素治疗为主,这两种治疗方法均存在弊端。干细胞是一群较原始的细胞,它们既具有自我更新的能力,也具有在合适的微环境里多向分化的潜能,理论上可提供丰富的胰岛细胞来源,因此干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells,IPCs)的研究为糖尿病的治疗提供了新的思路。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stemcells,BM-MSCs)可能是干细胞中有希望的候选细胞,它是一种具有很强的自我复制和可塑性的成体干细胞。许多体外研究已经将BM-MSCs成功诱导为IPCs,将其移植到糖尿病大鼠体内,可降低血糖。因此,本研究探索高糖条件下,尼克酰胺(Nicotinamide)联合Exendin-4是否能将BM-MSCs体外诱导为IPCs,并观测诱导成的IPCs回输至链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)大鼠体内对高血糖是否有治疗效果。材料与方法1、BM-MSCs细胞的分离提取及诱导在无菌条件下取3周龄大鼠股骨,利用直接贴壁法分离BM-MSCs,LG-DMEM(5.6mmol/L)培养传代。取第3代细胞上清液测胰岛素水平,用流式细胞仪检测BM-MSCs的表面标志。用HG-DMEM(25mmol/L)诱导14天,取上清液测胰岛素水平。加N(10mmol/L)诱导7天,再加E(10nmol/L)诱导7天,取上清液测胰岛素水平。诱导后的细胞进行DTZ染色检验,回输前用BrdU标记细胞。2、动物分组与处理将28只Wistar大鼠随机分为正常组和造模组(正常组8只)。造模组(20只)大鼠一次性腹腔注射1%STZ(50mg/kg)建立糖尿病模型。将造模成功的16只大鼠随机分成两组,即糖尿病组和实验组。将诱导后并已标记的细胞腹腔回输至实验组大鼠体内(5.6-6)×105/ml,正常组及糖尿病组注射生理盐水作为对照。3、检测指标及方法细胞培养及诱导的各阶段采集图像。DTZ染色的细胞采集图像。细胞回输后每周测大鼠体重及血糖。给药前和实验终止时各取血测空腹胰岛素(ELISA法)。实验终止时取大鼠肝脏、脾脏、胰腺,免疫组织化学双染法(SABC法)检测其中胰岛素和BrdU染色双阳性细胞的表达。经图像采集分析系统对各组胰腺中胰岛素染色阳性细胞区域占胰岛区域百分比进行分析。结果1、细胞分离培养及诱导结果细胞培养第13天时获得形态均一的第3代细胞,增殖能力旺盛。第3代细胞经HG-DMEM培养14天后,细胞增值能力旺盛并趋向团状、漩涡状生长。经N诱导7天后再加E诱导7天,细胞个体明显增大,呈多边形或近圆形,胞浆丰富,胞核变大,经DTZ染色后细胞呈橙红色。2、流式细胞仪检测结果BM-MSCs表达CD29、CD44阳性,阳性细胞百分率分别为95.47%,91.83%;而CD34(造血干细胞的表面特异性标志)、CD45(白细胞表面共同抗原)仅有微弱表达,细胞表达的百分率分别为1.05%,1.18%。3、生化及统计分析结果经药物诱导后的细胞上清液胰岛素水平显著高于高糖诱导后(P＜0.01),而高糖诱导后与低糖培养上清液胰岛素水平无统计学意义。造模成功后实验组和糖尿病组大鼠血糖及胰岛素无统计学意义。经细胞回输治疗后实验组大鼠血糖高于正常组(P＜0.01)低于糖尿病组(P＜0.05)。治疗后实验组大鼠胰岛素水平低于正常组(P＜0.05)高于糖尿病组(P＜0.05)。4、免疫组化及图像分析结果实验终止时免疫组织化学检测胰腺中胰岛素阳性细胞百分比发现正常组明显高于其他各组(P＜0.01),实验组低于正常组但是明显高于糖尿病组(P＜0.05),同时发现一定数量的胰岛素和BrdU染色双阳性细胞。在实验组的肝脏中发现少量胰岛素和BrdU双阳性细胞表达,脾脏中亦发现少量双阳性细胞表达。结论1、尼克酰胺(Nicotinamide)联合Exendin-4可以将骨髓间充质干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞。2、由骨髓间充质干细胞分化而来的胰岛素分泌细胞对大鼠糖尿病有一定的治疗作用。